长链非编码RNA LINC00346调控微小RNA-138-5p对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响

忽平，王丽媛

宫颈癌是全球第四大常见的女性癌症［1］，尽管诊断和治疗手段不断进步，但宫颈癌每年导致超过25万人死亡［2］。其转移性导致宫颈癌病人预后较差，反复治疗导致耐药性，因此发现宫颈癌新的治疗靶点，可有效提高病人生存率和生存质量。

研究表明，多种长链非编码RNA（long non-cod‐ing RNA，lncRNA）、微小RNA（micro RNA，miRNA/miR）在宫颈癌中表达异常，并通过lncRNA-miRNA的调控网络调控癌症的进展［3-4］。LINC00346在原发性肝癌组织和细胞株、胃癌和非小细胞肺癌中表达上调，促进癌细胞的生存、增殖、凋亡等过程，且与miR-138-5p存在结合位点［5-7］。miR-138-5p在宫颈癌中表达下调，可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌的恶性进展［8］。然而LINC00346和miR-138-5p在宫颈癌中的关系尚未可知。本研究检测宫颈癌组织中LINC00346的含量，并以宫颈癌（cer‐vical cancer）海拉细胞为研究对象，探讨LINC00346和miR-138-5p对海拉细胞增殖、凋亡影响的分子机制，旨在为宫颈癌分子靶向治疗提供新的参考。

1 材料与方法

1.1材料选取2018年1—12月于南阳市中心医院手术治疗的28例宫颈癌病人的宫颈癌组织及癌旁正常组织（距离宫颈癌组织边缘>5 cm）为研究对象，年龄（50.32±13.12）岁，范围为23～72岁，宫颈鳞癌23例，宫颈腺癌5例。所有病人术前未接受放疗和化疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，并且病人均签署知情同意书。

人宫颈癌细胞株海拉细胞由中科院上海细胞库提供；胎牛血清及RPMI-1640培养基由美国Hy‐clone公司生产，噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）及胰蛋白酶由美国Sigma-Aldrich公司生产；Tran‐swell板由美国Corning公司生产；引物、LINC00346干扰物（si-LINC00346）、miR-138-5p mimics（miR-138-5p）、miR-138-5p抑制物（anti-miR-138-5p）、阴性对照（si-NC、miR-NC和anti-miR-NC）由上海吉玛制药有限公司生产；凋亡检测试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司生产；Lipofectamine 2000转染试剂由美国Invitrogen公司生产；双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase Reporter Assay System）由美国Pro‐mega公司生产；Total RNA提取、Real-time PCR及逆转录试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司生产；Re‐al-time PCR仪由美国Bio-Rad公司生产。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将宫颈癌细胞株海拉细胞接种在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素及RPMI-1640培养基的培养液中，并于37℃5%二氧化碳培养箱中培养、传代。

1.2.2细胞转染 将对数生长期的海拉细胞应用上述细胞培养液稀释至1×l06个/毫升，接种于6孔板中（浓度为2×103个/孔），并于细胞融合度达到80%时，严格遵循转染试剂说明书进行转染。将si-NC、si-LINC00346、miR-NC、miR-138-5p、si-LINC00346+anti-miR-NC、si-LINC00346+anti-miR-138-5p的载体分别转染到培养好的海拉细胞孔板中。于转染48 h后收集细胞，进行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）验证，确保无误后进行后续相关实验。

1.2.3qRT-PCR检测LINC00346和miR-138-5p mRNA的表达 收集“1.2.2”中转染验证后的海拉细胞，依据RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒说明书要求提取总RNA，并快速将其逆转录为互补DNA（cDNA）。严格按照qRT-PCR的说明书合成LINC00346和miR-138-5p。LINC00346正向引物5′-CACCATGTTGGC‐CAGGCTGGT-3′，LINC00346反 向引物：5′-GGC‐CAAAGAGTGACCATCATC-3′；miR-138-5p正向引物：5’-GGAGCTGGTGTTGTGAATCA-3’，反向引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。用2−ΔΔCt进行数据分析。

1.2.4蛋白质印迹法检测海拉细胞中周期素依赖激酶抑制剂p21（P21）和胱天蛋白酶-3（caspase-3）的蛋白含量 收集转染验证后的各组海拉细胞，RI‐PA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，取适量蛋白溶液，100℃煮沸10 min。蛋白变性后，以每孔30μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用转膜仪湿转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。转膜后，用5%脱脂奶粉封膜2 h。分别加入P21和caspase-3一抗（P21：兔来源单克隆抗体，1∶1 000；caspase-3：兔来源单克隆抗体，1∶500），4℃孵育过夜。洗膜后，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶200），室温孵育1 h。洗膜后，避光滴加ELC显影液显影，凝胶成像拍照。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，Image J软件分析蛋白灰度值。

1.2.5MTT法测定细胞存活率 收集转染验证后的各组海拉细胞，于胰蛋白酶消化后，接种于96孔板中（2×103个/孔），培养48 h后每孔分别加入MTT溶液20μL，继续培养4 h后，弃去上清培养液，并于每孔加入DMSO溶解结晶150μL，室温条件下振荡5 min，应用酶标仪测定490 nm处的吸光度。存活率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.2.6流式细胞术测定细胞凋亡 收集转染后培养至对数生长期的各组海拉细胞，PBS清洗2遍，用RPMI-1640培养基稀释细胞密度为1×105个/毫升。应用上流式细胞仪并严格按照凋亡检测试剂盒说明书完成细胞凋亡率检测。

1.2.7双荧光素酶报告系统验证LINC00346与miR-138-5p的靶向关系 根据“1.2.2”方法完成海拉细胞培养及转染，将构建的LINC00346的野生型（WT-LINC00346）和突变型（MUT-LINC00346）双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC或miR-138-5p对海拉细胞进行共转染，转染48 h后裂解细胞，离心并收集上清，以海肾荧光素酶活性为内参，检测并计算萤火虫荧光素酶的相对活性。

1.3统计学方法应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1LINC00346在宫颈癌组织中的表达qRTPCR结果表明，与正常癌旁组织相比，宫颈癌组织中LINC00346 mRNA含量显著升高［（2.51±0.08）比（0.99±0.05），t=85.26，P<0.001］。

2.2敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞增殖和凋亡的影响转染si-LINC00346后，与si-NC组相比，si-LINC00346组宫颈癌海拉细胞中的LINC00346含量显著下降，P21和caspase-3蛋白含量升高，细胞存活率降低，凋亡率升高，均差异有统计学意义（P<0.05），见图1和表1。说明敲除LINC00346可以抑制海拉细胞增殖并促进细胞凋亡。

表1 敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

表1 敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。

组别si-NC si-LINC00346 t值P值重复次数9 9 LINC00346 1.00±0.05 0.33±0.03 34.47<0.001存活率/%100.00±6.13 52.84±4.39 18.76<0.001凋亡率/%8.19±1.00 23.39±1.64 23.74<0.001 P21 0.22±0.02 0.63±0.04 27.50<0.001 caspase-3 0.30±0.03 0.79±0.05 25.21<0.001

图1 敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞P21、caspase-3蛋白表达的影响

2.3LINC00346靶向调控miR-138-5pTargetscan预测结果显示，LINC00346的序列中含有与mi R-138-5p互补的位点，见图2。双荧光素酶报告系统结果显示，与miR-NC对照组相比，miR-138-5p组野生型WT-LINC00346的海拉细胞的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降［（0.24±0.03）比（0.97±0.05）］（t=37.56，P<0.001）；而突变型MUT-LINC00346的海拉细胞的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化［（0.98±0.05）比（0.99±0.05）］（t=0.42，P=0.677）。说明LINC00346靶向结合miR-138-5p。qRT-PCR结果显示，敲除LINC00346可显著上调miR-138-5p含量［（2.43±0.07）比（1.01±0.05）］（t=49.52，P<0.001）。说明LINC00346靶向负调控miR-138-5p表达。

图2 LINC00346靶向miR-138-5p

2.4转染miR-138-5p对海拉细胞增殖、凋亡的影响转染miR-138-5p后，与miR-NC组相比，miR-138-5p组海拉细胞中miR-138-5p含量升高，细胞存活率降低，凋亡率升高，P21和caspase-3蛋白含量升高，差异有统计学意义（P<0.001），见图3和表2。

表2 转染miR-138-5p对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

表2 转染miR-138-5p对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。

组别miR-NC miR-138-5p t值P值重复次数9 9 miR-138-5p 1.00±0.04 2.88±0.06 78.21<0.001存活率/%100.03±6.04 63.88±4.92 13.92<0.001凋亡率/%8.15±0.98 19.64±1.35 20.66<0.001 P21 0.21±0.02 0.54±0.04 22.14<0.001 caspase-3 0.29±0.03 0.67±0.04 22.80<0.001

图3 miR-138-5p对宫颈癌海拉细胞凋亡及P21、caspase-3蛋白表达的影响

2.5下调miR-138-5p能逆转敲除LINC00346对海拉细胞增殖和凋亡的影响为明确LINC00346通过调控miR-138-5p影响海拉细胞的增殖、凋亡，我们同时敲除LINC00346和下调miR-138-5p，结果显示，与si-LINC00346+anti-miR-NC组相比，si-LINC00346+antimiR-138-5p组miR-138-5p含量降低，细胞存活率升高，凋亡细胞数升高，P21和caspase-3蛋白含量降低，均差异有统计学意义（均P<0.001），见表3。说明下调miR-138-5p可逆转敲除LINC00346对海拉细胞增殖和凋亡的作用。

表3 下调miR-138-5p和敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

表3 下调miR-138-5p和敲除LINC00346对宫颈癌海拉细胞增殖、凋亡的影响/±s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。

组别si-LINC00346+anti-miR-NC si-LINC00346+anti-miR-138-5p t值P值重复次数9 9 miR-138-5p 1.02±0.05 0.30±0.03 37.04<0.001存活率/%52.79±4.35 88.29±5.32 15.50<0.001凋亡率/%23.41±1.65 11.91±1.37 16.09<0.001 P21 0.62±0.04 0.28±0.03 20.40<0.001 caspase-3 0.77±0.05 0.38±0.04 18.27<0.001

3 讨论

宫颈癌中异常表达的lncRNAs通过抑制或促进肿瘤发展，在宫颈癌的预后、肿瘤进展、侵袭转移、细胞凋亡和抗放射治疗中发挥调控作用［9-10］。

lncRNA LINC00346在多种癌症中表达异常，与癌症的进展和耐药性有关。LINC00346在膀胱癌组织中的表达显著上调，LINC00346基因敲除可抑制膀胱癌细胞增殖和迁移，诱导细胞周期阻滞和凋亡［11］。LINC00346在 胰 腺 癌 中 也 高 表 达，敲 除LINC00346抑制胰腺癌细胞增殖，导致细胞周期阻滞在G2/M期；在体外和体内，LINC00346的缺失也增强了胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性［12］。LINC00346在乳腺癌癌中过表达，与总体低生存率相关，可能是预后标志物［13］。但尚未有研究阐述LINC00346是否影响宫颈癌细胞的增殖、凋亡。本研究发现，与正常癌旁组织相比，LINC00346在宫颈癌组织中含量也显著升高，敲除LINC00346可以抑制海拉细胞存活率，提高细胞凋亡率及P21和caspase-3蛋白含量。说明LINC00346参与调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡。

本研究通过TargetScan预测发现，miR-138-5p与LINC00346序列中存在可结合位点，两者可能存在结合关系。miR-138-5p在胶质瘤［14］、胰腺癌［15］、肺腺癌［16］、结直肠癌［17］和膀胱癌［18］等多种癌症中表达下调，调节胶质瘤的血管生成，过表达miR-138-5p通过靶向沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）抑制胰腺癌的自噬和肿瘤生长，抑制肺腺癌的细胞的上皮-间充质转化（EMT）、增殖和转移，也可靶向人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）抑制结直肠癌。miR-138-5p在宫颈癌中也表达下调，miR-138-5p的表达降低与宫颈癌病人的FIGO分期晚期、分化不良、淋巴结转移和总体生存率低下有关，miR-138-5p的过度表达可以通过靶向SIRT1抑制细胞增殖，阻滞G0/G1期细胞，诱导细胞凋亡［19］。本研究通过双荧光素酶报告系统发现，LINC00346靶向结合miR-138-5p，且下调LINC00346可上调miR-138-5p表达。进一步研究表明，过表达miR-138-5p可抑制细胞存活诱导细胞凋亡，下调miR-138-5p表达可逆转敲减LINC00346对海拉细胞增殖和凋亡的作用，间接说明LINC00346靶向miR-138-5p在海拉细胞的增殖凋亡中发挥调节作用。

综上，本研究明确了lncRNA LINC00346在宫颈癌组织中表达上调，在宫颈癌海拉细胞中lncRNA LINC00346靶向miR-138-5p调控宫颈癌海拉细胞增殖和凋亡。lncRNA LINC00346可能是宫颈癌潜在的分子靶点。