中药材蛇莓标准关键控制指标研究

金凤华，程庆兵，刘业飞，叶红兵，叶玲

中药蛇莓为蔷薇科（Rosaceae）蛇莓属（Duch‐esnea）植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草。蛇莓始载于《名医别录》，为民间常用中草药，《中国药典》2020年版四部“成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片”中有蛇莓的来源和名称描述［1］。研究表明，蛇莓的主要化学成分为甾醇类、糖苷类、萜类、黄酮类等，主要应用于降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理作用［2-7］。三萜类化合物齐墩果酸和熊果酸结构相似，性质相近，试验表明在一般薄层色谱方法中难以分离。该研究在前期对蛇莓三萜类成分做了大量试验研究，结合相关文献［8-10］，采用相应的薄层分离条件，对蛇莓中的三萜类成分进行了薄层色谱鉴别研究。文献［11-19］报道，鞣花酸是蛇莓药材中含量较高的成分之一，且鞣花酸具有增强免疫、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等药理作用。课题组查阅《中国植物志》《中华本草》《中药大辞典》及近现代药材标准，均有收载蛇莓，但检验项目单一、检验内容简单，均未收载蛇莓质量控制关键性指标的检验项目，为提升蛇莓的质量控制标准，课题组收集10批蛇莓中药材（由安徽省食品药品检验研究院提供），于2020年11月至2021年8月对中药材蛇莓质量控制的关键性指标分别用薄层色谱法进行定性考察及高效液相色谱法进行定量分析，为完善和提升蛇莓药材的质量控制标准提供科学有力的研究依据。

1 仪器与试药

1.1仪器XPE205型电子天平（Mettler-Toledo），TUBE MILL CS025型粉碎机（IKA），TLCVISUALIZ‐ER2型薄层成像系统（瑞士CAMAG公司），CAMAGLinomat-5型半自动点样仪（瑞士CAMAG公司），ADC-2自动展开仪（瑞士CAMAG公司）。S120H型超声波清洗器（德国ELMA公司），Milli-QAdvantage A10型超纯水机（MILLIPORE）；U-3000型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（美国Thermo Fisher Sci‐entific公司）。

1.3样品蛇莓药材分别从福建、广东、安徽等药材市场收集共10批（安徽省食品药品检验研究院提供，样品编号Y1～Y10），经合肥市食品药品检验中心主任中药师刘业飞鉴定为蔷薇科（Rosaceae）植物蛇莓Duchesneaindica（Andr.）Focke的干燥全草。

2 方法与结果

2.1薄层色谱分析

2.1.1对照品溶液的配制 取齐墩果酸、熊果酸对照品，分别加无水乙醇制成0.2 g/L的溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 精密称取不同产地蛇莓粉末2 g于50 mL锥形瓶中，加三氯甲烷20 mL。超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇-三氯甲烷（1∶3）的混合溶液1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3蛇莓药材薄层色谱分析 （1）点样：取蛇莓供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液、熊果酸对照品溶液各2μL，点样于同一硅胶G薄层板上。（2）展开：点样后浸入1%碘-二氯甲烷溶液［5］中，至过起始线迅速取出，立即用玻璃板履盖，30 min后取下玻璃板，挥去薄层板上残留的溶液。以环己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）为展开剂，展开。（3）显色：取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。观察：分别置紫外光灯光（365 nm）和日光下检视。（4）图谱分析：薄层色谱图见图1。由图可知，蛇莓供试品色谱与熊果酸对照品色谱在对应位置显示相同的颜色斑点，在与齐墩果酸对照品色谱对应的位置上，无明显的相同颜色斑点。

2.1.4薄层色谱方法学验证

2.1.4.1溶剂优化试验 分别考察三氯甲烷、甲醇、无水乙醇3种溶剂的超声提取效率。取蛇莓药材Y4供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液、熊果酸对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（经1%碘－二氯甲烷溶液预处理），以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。置紫外光灯（365 nm）下检视。可知，采用溶剂三氯甲烷超声提取效果更佳。

这里 s表示向量，其第i个元素为 si，i=1,2,...,n是个常数。而对称矩阵B称为模块度矩阵，其元素为：

2.1.4.2专属性试验 取齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，按（1∶1）比例混合，加无水乙醇制成含齐墩果酸0.1 g/L、熊果酸0.1 g/L的混合溶液。取蛇莓Y4供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液、熊果酸对照品溶液、齐墩果酸熊果酸混合对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（未经1%碘－二氯甲烷溶液预处理）；另同法操作，点于同一硅胶G薄层板上（经1%碘－二氯甲烷溶液预处理），以环己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。分别置日光和紫外光灯光（365 nm）下检视，可知，未经1%碘－二氯甲烷溶液预处理的薄层板，齐墩果酸、熊果酸为混合斑点，不能得到有效分离。经1%碘－二氯甲烷溶液预处理，齐墩果酸对照品和熊果酸对照品能得到有效分离，斑点清晰可辨。

2.1.4.3稳定性试验 将“2.1.1”和“2.1.2”项下的熊果酸对照品溶液和供试品溶液放置24 h，按2.1.3操作，分别点样于三个生厂商（默克化工技术有限公司，青岛海洋化工厂分厂，青岛邦凯高新技术材料有限公司）的硅胶G薄层板。实验结果表明，该方法在24 h内稳定性良好，在不同厂家生产的硅胶G薄层板上色谱斑点重现性良好。

2.2鞣花酸含量测定

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸对照品约13 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取不同产地蛇莓药材粉末（过四号筛）0.2 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重，回流提取60 min，取出放置室温时，再次称重，补足甲醇重量，摇匀，用0.45μm微孔有机滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3色谱条件与系统适用性实验 色谱柱：依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～5 min，10%～17%A；5～15 min，17%A；15～35 min，17%～25%A；35～40 min，10%A；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：10μL。理论板数按鞣花酸计不小于6 000。

2.2.4方法学试验

2.2.4.1线性范围考察 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液2.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定峰面积积分值，分别为2.880 7、6.950 8、11.035 5、13.799 0、20.631 6、27.387 6，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：A=1.363V+0.149，r=1.0（n=6）。实 验表明：浓度 为12.289 9 mg/L的鞣花酸，在所试进样体积2.0～20.0μL范围内与峰面积积分值具有良好的线性关系。

2.2.4.2精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，重复进样5次，按照上述色谱条件测定其峰面积积分值，其相对标准差（RSD）=0.3%，表明仪器精密度较好。

2.2.4.3重复性试验 精密称取同一蛇莓样品（Y2）供试品溶液5份，每份0.2 g，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定鞣花酸含量，其峰面积测量值的RSD=0.3%（应≤2.0%），表明方法重复性较好。

2.2.4.4稳定性试验 分别吸取上述Y2供试品溶液10μL，配置后立即注入液相色谱仪，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定鞣花酸含量，考察其峰面积RSD为0.19%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4.5准确度试验 精密称取同一蛇莓样品（Y2）6份，每份称取0.1 g，至100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液25 mL，精密加入甲醇25 mL，精密称定，回流提取60 min，取出放置室温时再次称重，补足甲醇重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，按“2.2.3”项下色谱条件测定鞣花酸含量，计算平均回收率为99.21%，RSD为1.8%。

2.2.4.6样品测定结果 精密称取上述10批蛇莓样品各两份，每份0.2 g，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定鞣花酸含量，测定了10批样品中鞣花酸的含量，结果见表1。

参照《安徽省中药材标准》起草工作技术指引要求，设定含量测定限度公式如下：

式中μ为含量测定限值，xˉ为蛇莓样本平均数，t为置信水平为99%的检验值，s为样本的标准偏差，n为样本批数，MU为不确定度。

从表1可以看出收集到的样品含量差异较大，为了保证药材质量，结合限度计算公式，拟定含量测定限值为2.0 mg/g。

表1 蛇莓样品中鞣花酸含量测定结果值

3 讨论

3.1定性鉴别与分析课题组在薄层色谱鉴别实验中，比较了三氯甲烷、无水乙醇、甲醇3种溶剂的提取效果，发现以三氯甲烷为溶剂，超声提取的样品成分多且相应薄层色谱的斑点清晰；采用了多种展开剂如二甲苯-丙酮-乙醇-氨水（50∶50∶10∶1）氨水预饱和、环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶0.5）、环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶1∶0.2）等，经试验论证环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）展开效果较好。因熊果酸和齐墩果酸为同分异构体，且常同存在于同一药材中，一般的薄层色谱方法不能将二者分离。有报道称蛇莓药材薄层色谱中，与齐墩果酸对照品相应的位置上，显示相同颜色的斑点，经课题组试验发现，蛇莓药材薄层色谱中，若不用1%碘－二氯甲烷溶液预处理，在与齐墩果酸对照品斑点相应的位置上，确实显示相同颜色的“斑点”，其实该“斑点”实为熊果酸与齐墩果酸的混合斑点，用1%碘－二氯甲烷溶液预处理后，熊果酸与齐墩果酸分离，从薄层色谱图中可见，蛇莓是与熊果酸对照品相应的位置上，显示相同颜色的斑点，而非齐墩果酸。该发现对鉴别蛇莓药材的真伪优劣意义重大。

3.2含量测定探讨与研究课题组在溶解鞣花酸对照品时，发现鞣花酸在乙醇、低浓度甲醇中的溶解度较低，可在甲醇中溶解。样品提取时选用了95%乙醇、三氯甲烷、甲醇3种溶剂进行比对，结果发现鞣花酸在甲醇中提取效果最佳；课题组查阅相关文献［20］，结合试验摸索，采用了两种提取方式—加热回流、超声，结果表明，回流提取效果较好；加热回流时间是经相同实验条件下分别采用0.5 h、1.0 h、1.5 h等多个时间点回流提取确定的，试验发现回流提取1.0 h效率最高。这10批蛇莓药材分别产于安徽、广东、辽宁等地，各地所产蛇莓中鞣花酸含量差别甚大，最大含量与最小含量约相差6倍，不同产地蛇莓主成分含量的研究，对蛇莓药材种植基地的选取有指导性意义。