谷胱甘肽过氧化物酶4在雷公藤内酯酮激活结肠癌细胞铁死亡中的作用

李慧霞 尤伟波 陈丽 王建平

结肠癌是全球范围内较为常见的消化道恶性肿瘤之一，极大威胁着人类的健康[1]。外科手术切除是其最佳治疗手段，但多数患者诊断时已处于中晚期，失去了最佳的手术机会[2-3]。尽管放化疗、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂等治疗能有效提高结肠癌的治疗缓解率，但结肠癌、直肠癌的5年生存率仅为57.6%和56.9%[1]。因此，亟需探索新的抗肿瘤疗法。雷公藤内酯酮（triptoinde，TN）是从雷公藤根茎分离提取的三萜类化合物，具有广泛的抗癌作用[4-8]；但其在结肠癌中的作用及相关机制目前尚未明确。细胞铁死亡是一种铁离子依赖的脂质氧化物过载诱发的调节性死亡，研究证实多种抗癌药物可通过激活细胞铁死亡来发挥抗癌作用[9-10]。因此，本研究对细胞铁死亡关键调控蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）在TN激活结肠癌细胞铁死亡中的作用作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂和细胞 TN（批号：38647-11-9，纯度≥97%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，GPX4抗体（批号：ab125066）、β-actin（批号：ab6276）购自英国Abcam公司，阴性载体（批号：GVAP0200268）购自上海吉凯基因科技有限公司，GPX4过表达载体（批号：GOSV0282718）购自上海吉凯基因科技有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号：S0033S）、CCK-8（批号：C0038）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号：S0131S）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（批号：S0053）、Calcein AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（批号：C2015S）、二甲基噻唑二苯基四氮唑溴盐[3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液（批号：C0009S）均购自上海碧云天生物科技有限公司。结肠癌细胞株HCT116购自中国医学科学院细胞库。本实验在浙江大学医学院完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HCT116细胞置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基中，放在37℃、5% CO2、饱和湿度的孵育箱中培养；每隔1 d更换1次培养基。

1.2.2 细胞分组与处理 将体外培养的HCT116细胞分为5组，即对照组、TN组、铁死亡抑制剂Feroptosis-1（Fer-1）+TN组、阴性载体组、GPX4过表达组。对照组细胞不作任何处理。TN组细胞加入15.0 nmol/L的TN处理48 h。Fer-1组细胞用2 μmol/L Fer-1预处理2 h后，加入15 nmol/L TN处理48 h；阴性载体组、GPX4过表达组细胞分别用 10 μl阴性载体、10 μl GPX4过表达转染48 h后，加入15 nmol/L TN处理48 h。

1.2.3 细胞转染 阴性载体和GPX4过表达载体由吉凯基因科技有限公司合成。将1×105个HCT116细胞接种于6孔板，用无双抗、无血清的培养基培养，待细胞融合至70%～80%时进行病毒转染。按照说明书方法分别取10 μl阴性载体、GPX4过表达载体加入细胞中，继续培养12 h后观察细胞状态。在荧光显微镜下观察转染情况，经转染后12、24、48 h加入嘌呤霉素，获取阴性载体和GPX4过表达表达细胞。

1.2.4 细胞存活率检测 采用CCK-8法。HCT116细胞按0.2×103个/孔接种至96孔板中，置于培养箱过夜，待贴壁后加入 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 nmol/L的TN继续培养 48 h。每孔加入20 μl MTT溶液，37℃温箱反应2～4 h，使用酶标仪在波长562 nm处检测吸光度（optical density，OD）值。细胞存活率=（OD 值给药组-OD 值空白孔/OD 值对照组-OD 值空白孔）×100%。

1.2.5 死亡细胞比例检测 采用死细胞染色法。5组HCT116细胞经药物处理后，用PBS轻轻洗去培养基，加入经检测缓冲液稀释1 000倍的Calcein AM/PI工作液500 μl，室温下避光孵育30 min。使用荧光显微镜拍摄细胞染色情况并统计死亡细胞比例。

1.2.6 细胞内GSH含量检测 5组HCT116细胞经药物处理后，用PBS轻轻洗涤1次，1 500 r/min离心5min，取细胞沉淀，加入蛋白去除试剂充分混匀；再加入液氮，37℃反复冻融2次，冰上静置5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液。根据GSH检测试剂盒说明书制作标准品，加样后使用酶标仪在波长412 nm处检测OD值，根据不同浓度标准品测得的OD值作出标准曲线，以对照组为参照，计算细胞内GSH相对含量。

1.2.7 细胞内ROS含量检测 采用流式细胞术检测。5组HCT116细胞经药物处理后，用PBS轻轻洗涤1～2次，制备细胞悬液。加入适量10 μmol/L的二氯荧光黄双乙酸盐稀释液对重悬细胞进行染色，置于37℃培养箱内孵育20 min，转至流式细胞仪进行检测，获得平均荧光强度值，以对照组为参照，计算细胞内ROS相对含量。

1.2.8 细胞内MDA含量检测 5组HCT116细胞经药物处理后，用PBS轻轻洗涤1～2次，加入细胞裂解液充分混匀，待细胞裂解完全后，取0.1 ml裂解液，加入0.2 ml MDA检测工作液，置于100℃金属浴中15 min后，1 500 r/min离心5 min，取上清液。使用酶标仪在波长532 nm处检测OD值，以对照组为参照，计算细胞内MDA相对含量。

1.2.9 细胞GPX4蛋白表达水平检测 将上述5组细胞裂解液0.1 ml，置于4℃离心机，12 000 r/min离心15 min，取上清液。每孔20 μg总蛋白用10%聚丙烯酰胺梯度凝胶进行电泳分离1.5～2.0 h，采用湿转法将蛋白转至聚偏氟乙烯膜2 h，取出聚偏氟乙烯膜后用10%脱脂牛奶室温下封闭30 min，根据目标蛋白的分子量裁膜后，分别加入GPX4、β-actin一抗，4℃孵育过夜；取聚偏氟乙烯膜洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h，洗涤3次，利用电化学发光技术进行显影和定影，使用Image J软件计算各个条带的灰度值，即蛋白表达水平。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度TN处理48 h后HCT116细胞存活率比较 随着TN浓度的增加，HCT116细胞存活率逐渐下降（P＜0.05），见图 1。TN对 HCT116细胞的半抑制浓度 （half maximal inhibitory concentration，IC50）为15.37 nmol/L，故本研究选择最接近IC50的浓度15 nmol/L为TN给药终浓度。

图1 不同浓度雷公藤内酯酮处理48 h后HCT116细胞存活率比较

2.2 5组HCT116死亡细胞比例比较 5组HCT116死亡细胞比例比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，TN组死亡细胞比例明显升高（P＜0.05）；与TN组比较，Fer-1组死亡细胞比例明显降低（P＜0.05）；与阴性载体组比较，GPX4过表达组死亡细胞比例明显降低（P＜0.05），见图 2（插页）。

图2 5组HCT116死亡细胞比例比较（a：细胞染色图，绿色荧光所示为活细胞，红色荧光所示为死细胞；b：柱状图，*P＜0.05）

2.3 5组 HCT116细胞内 GSH、ROS、MDA含量比较5组HCT116细胞内GSH、ROS、MDA含量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与对照组比较，TN组细胞内GSH含量明显减少（P＜0.05），ROS、MDA含量均明显增加（均P＜0.05）；与TN组比较，Fer-1组细胞内GSH含量明显增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明显减少（均P＜0.05）；与阴性载体组比较，GPX4过表达组细胞内GSH含量明显增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明显减少（均P＜0.05），见图3。

图3 5组HCT116细胞内GSH、ROS、MDA含量比较

2.4 5组HCT116细胞GPX4蛋白表达水平比较 与对照组比较，TN组细胞GPX4蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与TN组比较，Fer-1组细胞GPX4蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与阴性载体组比较，GPX4过表达组细胞GPX4蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），见图4。

图4 5组HCT116细胞GPX4蛋白表达水平比较（a：电泳图；b：柱状图，*P＜0.05）

3 讨论

TN属于三萜类化合物，具有极强的抗癌活性。体外内研究发现，TN能明显抑制胃癌、胰腺癌、肺癌等实体肿瘤细胞增殖[4-8]。Xiang等[4]研究发现，对于高侵袭、未分化的胃癌细胞，TN的IC50为5.1～11.1 nmol/L，而对正常胃细胞株 GES-1的 IC50为 20.2 nmol/L。Wang等[5]研究发现，TN对食管癌细胞株HONE-1的IC50为23.56 nmol/L，而5～500 nmol/L的TN对正常食管细胞株NP-69无细胞毒性。Zhang等[6]也研究证实，TN对多种胰腺癌细胞的IC50为10 nmol/L，对正常胰腺细胞株HSF的IC50＞50 nmol/L。本研究结果显示，TN对HCT116细胞的IC50为15.37 nmol/L，提示TN对结肠癌细胞具有明显细胞毒性作用，能抑制结肠癌细胞增殖。

细胞铁死亡是由铁离子依赖的脂质过氧化物异常堆积导致的一种新型细胞死亡方式[9]，特征性表现为脂质过氧化物及ROS过量蓄积；在形态学上表现为细胞缩小，线粒体嵴消失或减少、线粒体内外膜浓缩；在分子水平上表现为GPX4活性减弱、GSH耗竭、脂质氧化物无法被还原。在二价铁离子的催化下，脂质氧化物被氧化，从而产生大量ROS，导致细胞氧化应激损伤性死亡。然而，多种肿瘤细胞能够适应性维持细胞内过氧化脂质代谢平衡，保护细胞免受铁死亡损害。其中GPX4是降低脂质过氧化物含量的一种重要酶类，能催化脂质过氧化物还原，降低细胞内脂质过氧化物含量，抑制细胞铁死亡[11-12]。研究表明，GPX4抑制剂能诱发癌细胞铁死亡，发挥抗癌作用[9]。Hou等[13]研究表明，二甲双胍通过降低GPX4表达来激活细胞铁死亡，从而抑制乳腺癌细胞增殖。Gao等[14]研究发现，布洛芬能降低GPX4表达，从而发挥抗胶质瘤的作用。Zhang等[15]研究表明，GPX4抑制剂RSL3能明显增加顺铂的化疗敏感性。本研究结果显示，TN能增加HCT116细胞内ROS、MDA含量，同时降低GSH含量；TN+Fer-1组细胞内ROS、MDA含量较TN组均明显减少，而GSH含量明显增加，这说明TN能激活HCT116细胞铁死亡。进一步研究发现，TN能抑制GPX4表达，并被Fer-1部分逆转；经GPX4过表达后，TN诱导的ROS、MDA含量均明显减少，GSH含量明显增加，这说明GPX4参与TN激活HCT116细胞铁死亡的过程。可见，TN具有抗结肠癌的作用，而GPX4是TN抗癌的关键靶点，通过调控TN激活癌细胞铁死亡作用。

综上所述，TN通过抑制GPX4激活结肠癌细胞铁死亡，从而抑制癌细胞增殖。