和田部分地区和田黑鸡3种球虫分子检测与鉴定

宋显明，信璐瑶，侯旻昱，邓金华，方 晨，李泽宇，赵永旭，齐 萌*

(1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831199；2.塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300)

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的肠道原虫病，主要表现为食欲减退、贫血、血便、消瘦和生产性能下降等临床症状，致死率较高，严重危害养鸡业健康持续发展[1]。可感染鸡的7种球虫中，以柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)和毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)的致病力最强，病死率可达80.0%以上；布氏艾美耳球虫(Eimeriabrunetti)可引起致死性血性腹泻；堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)、巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)、和缓艾美耳球虫(Eimeriamitis)及早熟艾美耳球虫(Eimeriapraecox)致病性较弱，一般不引起明显临床症状和病理变化[2]。自然情况下，鸡球虫感染多呈混合感染，在不同国家和地区流行的球虫种类存在差异。随着分子生物学的发展，多种宿主源球虫均可进行特异种类鉴定，并可进行种系发育分析[3]。

和田黑鸡是优良的肉蛋兼用型地方品种鸡，主要分布于和田地区民丰县、洛浦县和和田县。在养殖过程中，受传统养殖观念影响，养殖户对和田黑鸡的疾病预防意识薄弱，饲养管理粗放，多种疾病常混合发生，导致死亡，造成一定的经济损失[4]。为了解和田黑鸡柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫的感染情况，采用PCR对和田部分地区和田黑鸡粪便样本DNA进行检测和序列分析，以期为该地区鸡球虫病的防治提供基础参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2020年6月至2021年4月，分别于和田县、洛浦县、民丰县和墨玉县的11个林下平养模式规模为2 000只～3 000只和田黑鸡养殖户收集鸡粪便样本，随机采集鸡刚排出的新鲜粪便样本，每份粪便样本2 g～5 g，每只鸡计为1份样本，装入洁净自封袋，编号，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.3 主要仪器 T100型梯度PCR仪，凝胶成像系统仪，Bio-Rad公司产品；小型台式高速离心机，艾本德股份公司产品；DYY-12型琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；电泳槽，北京君意东方电泳公司产品。

1.2 方法

1.2.2 球虫的PCR扩增和电泳分析 基于球虫ITS基因位点，参考文献[5]设计的柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫特异性引物，引物序列见表1，由苏州金维智生物科技有限公司合成。对所有鸡粪便样本DNA进行PCR扩增。PCR扩增反应体系均为25 μL，包括2× EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL。每次PCR扩增均设阳性对照和阴性对照，阳性对照样本为已鉴定保存的柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫的DNA样本，阴性对照为灭菌的双蒸水。PCR产物检测使用10 g/L的琼脂糖凝胶，取5 μL第2轮PCR产物加入琼脂糖凝胶孔中，110 V电压电泳30 min。将凝胶取出放入紫外凝胶成像分析系统中观察并拍照。

表1 3种鸡艾美耳球虫特异性引物序列

1.2.3 序列分析和种类鉴定 所有成功扩增的PCR产物均进行双向测序，由苏州金维智生物科技有限公司完成。在NCBI数据库中进行Blast同源序列搜索，用Clustal X 2.1软件对所获序列进行比对分析，根据比对结果鉴定球虫种类。下载相关球虫同源序列，采用Mega X软件，选择邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建种系发育进化树，其可靠性用Bootstrap分析检测，进行1 000个重复。

2 结果

2.1 和田黑鸡3种球虫感染情况

基于3种球虫ITS基因位点，对449份和田黑鸡粪便DNA样本进行PCR检测，发现74份呈球虫阳性，感染率为16.5%(74/449)。11个采样点中，10个均呈球虫阳性，以和田县4的和田黑鸡感染率最高，为40.9%(9/22)，而在墨玉县1的和田黑鸡样本中未检测出球虫阳性；不同采样点和田黑鸡球虫感染率差异显著(P<0.05)。其中，柔嫩艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染率分别为6.0%(27/449)、12.0%(54/449)和2.4%(11/449)，柔嫩艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫混合感染率为1.6%(7/449)，布氏艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫混合感染率为2.4%(12/449)，柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫三者混合感染率为0.4%(2/449)(表2)。

表2 不同采样点和田黑鸡3种艾美耳球虫感染情况

2.2 不同日龄和田黑鸡3种球虫感染情况

不同日龄和田黑鸡球虫感染率统计学差异显著(P<0.05)，以40日龄～80日龄鸡球虫感染率最高，为20.4%(58/284)，2种和3种球虫混合感染率分别为6.3%(18/284)和0.7%(2/284)，以布氏艾美耳球虫感染率较高，为15.5%(44/284)；小于40日龄鸡球虫感染率为9.6%(11/115)，主要为柔嫩艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫感染，感染率分别为6.1%(7/115)和4.3%(5/115)；大于80日龄鸡球虫感染率为10.0%(5/50)，主要为布氏艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染，感染率分别为10.0%(5/50)和2.0%(1/50)(表3)。

表3 不同日龄和田黑鸡3种艾美耳球虫感染情况

2.3 球虫序列分析和种类鉴定

25条柔嫩艾美耳球虫序列经比对分析，鉴定出2种序列，分别命名为E.tenella-Type1(n=8)和E.tenella-Type2(n=17)，2种序列存在1个碱基差异，分别与巴基斯坦鸡源柔嫩艾美耳球虫分离株序列(GenBank登录号：MN830381)和印度鸡源柔嫩艾美耳球虫分离株序列(GenBank登录号：GQ856298)同源性为100%。54条布氏艾美耳球虫序列经比对分析，均与印度鸡源布氏艾美耳球虫分离株序列(GenBank登录号：GQ856292)和澳大利亚鸡源布氏艾美耳球虫分离株序列(GenBank登录号：AF446057)同源性为100%。11株毒害艾美耳球虫序列经比对分析，均与广东鸡源毒害艾美耳球虫分离株序列(GenBank登录号：FJ449693)同源性为100%。

进化树显示(图1)，本调查中获得的3种球虫序列与鸡源不同种类球虫均处于同一个进化支上。其中柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫序列形成一个亚群，布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫序列形成一个亚群，堆型艾美耳球虫单独形成一个亚群。

▲本研究中所获序列

3 讨论

不同国家和地区鸡球虫感染情况存在差异，但均普遍感染。在印度北部，Kumar S等[6]报道3个肉鸡养殖场鸡球虫感染率为81.3%(61/75)，以柔嫩艾美耳球虫为优势感染种类。在日本，Matsubayashi M等[7]对21个县37个肉鸡、蛋鸡养殖场进行调查，发现鸡球虫总感染率为89.2%(33/37)，以布氏艾美耳球虫为优势感染种类。Godwin R M等[8]对澳大利亚规模化场和散养条件下肉鸡进行调查发现，规模化场肉鸡球虫的感染率为98.4%(123/125)，以堆型艾美耳球虫为主要感染虫种，而散养肉鸡球虫的感染率为80.7%(109/135)，以和缓艾美耳球虫为优势虫种。在我国，Lan L H等[9]报道浙江省5个地区规模化场平养肉鸡球虫总感染率为30.7%(95/310)，以柔嫩艾美耳球虫为优势感染种类。Geng T等[10]报道河南省和湖北省18个地区规模化平养肉鸡场中有16个呈球虫阳性，阳性场鸡球虫最高感染率为97.2%(305/318)，河南省以和缓艾美耳球虫为优势虫种，而湖北省以柔嫩艾美耳球虫为优势感染种类。本次调查发现，和田4个地区11个和田黑鸡养殖场有10个呈球虫感染阳性，3种致病性球虫总感染率为16.5%(74/449)，低于上述报道鸡球虫感染率，这可能与本研究仅检测了3种球虫，其他种类球虫未检测有关；发现和田黑鸡感染以布氏艾美耳球虫为优势感染种类，感染率为12.0%(54/449)，与上述报道相一致。

研究表明，鸡球虫的感染与鸡群日龄有较大关系。陈丽凤等[11]对秦皇岛地区10个养殖场肉鸡进行调查，发现15日龄～45日龄鸡群为球虫易感鸡群。李微等[12]对哈尔滨地区218个养殖场进行调查，发现球虫感染率随日龄的增长逐渐增大，至60日龄感染率达到最高，为76.5%(52/68)，60日龄以上感染呈降低趋势。王开胜等[13]对新疆昌吉地区15家养殖场进行调查，发现17日龄～62日龄的鸡群球虫感染率为100%。本研究发现40日龄～80日龄鸡群球虫感染率相对高于其他年龄段的鸡群，感染率为20.4%(58/284)，与上述的调查结果基本相一致。不同地理环境、养殖方式、养殖规模和饲养管理等因素对鸡球虫感染影响差异较大，应合理使用抗球虫药物，定期进行圈舍消毒及垫料更换，做好不同日龄鸡球虫病的防控。

鸡感染球虫后，常存在混合感染，根据形态学观察对球虫进行准确的种类鉴定存在一定困难。ITS基因可准确鉴定球虫种类，还可分析不同种类之间的亲缘关系[14]。此次调查发现部分和田黑鸡样本呈球虫混合感染，感染率为4.9%(22/449)，系统进化树显示所获3种致病性球虫序列亲缘关系较近，同处一个进化支上。

调查结果显示，和田部分地区的和田黑鸡致病性球虫感染较普遍，以布氏艾美耳球虫为感染虫种，以40日龄～80日龄鸡感染率较高。养殖过程中，应针对鸡易感年龄段合理使用抗球虫药，防止球虫产生耐药性。