动物传染病mRNA疫苗研究进展

秦立得，赵思俊，刘华雷，宋翠平，田文霞

(1.山西农业大学动物医学学院，山西晋中 030801；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032)

疫苗(vaccine)在动物疫病的预防与控制中发挥了重要的作用，为应对新发动物疫情及不断变异的流行毒株或菌株，疫苗需要不断的更新，并应具有成本低、研发速度快、生产方便快捷、保护效果好、使用方便等优点。新技术在疫苗的研发中得到了重视与应用，其中mRNA疫苗是研究的重点。特别是mRNA疫苗与传统疫苗相比具有研发生产周期短的显著优点，使其适用于新发病疫情的快速应对及紧急免疫预防。在新冠肺炎(COVID-19)疫情期间，多种mRNA疫苗被紧急研发成功并通过临床验证，在全球广泛应用，取得了良好的免疫保护效果。如辉瑞公司和BioNTech公司联合开发的BNT162b2疫苗是第一批临床应用的COVID-19疫苗，在英国、加拿大等多国大规模使用，临床Ⅲ期试验测试免疫保护效力高达95%[1]。论文就mRNA疫苗原理、体内传递方式、诱导免疫机理、优缺点及在动物疫病防控中的研究进行了综述。

1 mRNA疫苗

20世纪90年代发现外源DNA和mRNA可以在动物体内翻译产生蛋白质，并诱导动物产生特异性免疫。但受mRNA不稳定和易被机体模式识别受体(PRRs)识别并降解等因素限制，使研究更侧重于DNA疫苗，mRNA更多被当做免疫佐剂进行研究[2]。2005年Weissman等研究证明使用修饰的外源mRNA可以降低在体内诱导免疫反应程度并避免快速降解，2008年Karikó等发现使用假尿苷代替尿苷可增强mRNA的稳定性并提升翻译能力，此外大量研究从密码子优化、人工合成mRNA、优化mRNA结构等多方面着手，增强了mRNA的稳定性和翻译能力，并降低了mRNA自身的免疫原性，这些研究为mRNA疫苗的研究及推广应用清除了主要障碍[3]。目前mRNA疫苗在传染病预防、癌症和其他免疫疾病治疗等方面得到研究，并有多种抗癌、抗病毒、抗病mRNA疫苗已进入临床试验或已用于临床[4]。

mRNA疫苗可分为普通mRNA疫苗和自扩增mRNA疫苗。mRNA疫苗的结构与mRNA相同，包括5′-末端“帽”结构(Cap)、5′-非翻译区(5′-UTR)、开放阅读框(ORF)、3′-UTR和3′多聚腺苷酸序列(poly(A))，mRNA翻译产生目的蛋白。抗传染病mRNA疫苗的ORF编码目的蛋白质，通常为诱导产生中和抗体的蛋白，包括糖蛋白、刺突蛋白、核蛋白等[5]。传统的mRNA分子在细胞内不能复制，而新型的自我复制型/自扩增mRNA(self-amplifying mRNA,saRNA,SAM)可在细胞内扩增，可翻译产生更多的蛋白质。与普通mRNA结构相比，saRNA增加了一个来源于甲病毒、黄病毒等单股正链RNA病毒基因组的非结构蛋白基因(nsPs)ORF(图1)。nsPs翻译产物能够合成RNA依赖RNA聚合酶复合物，指导saRNA大量复制并干扰细胞内免疫反应，可在细胞内高水平的表达外源基因。saRNA细胞内复制和翻译的过程，模拟了单股正链RNA病毒感染细胞后扩增的过程，可诱导机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，起到了免疫增强剂的作用[6]。Annette B.Vogel等研究发现普通mRNA和saRNA疫苗都能诱导机体产生对禽流感病毒的保护力，只需要使用1.25 mg的saRNA便可与使用80 mg的mRNA诱导产生相同的保护水平，使用剂量相差64倍[7]。此外，在saRNA中还可插入CD40L、CD70、IL-4等免疫调节蛋白质基因以增强免疫效果[8]。但saRNA疫苗也存在诸多缺点，saRNA比mRNA分子质量大，对saRNA的设计和保存提出了更高的要求；saRNA细胞内扩增激活免疫系统并诱导一系列免疫反应，严重者甚至会对机体造成损伤[9]。

图1 mRNA和saRNA结构

2 mRNA传递及诱导免疫反应

mRNA疫苗可以采用肌肉注射、皮下注射、电转染等方式进行免疫，最主要靶细胞是树突状细胞等专职抗原递呈细胞[8]。mRNA必须穿过细胞膜到达细胞质才能进一步的翻译为蛋白质，而在动物体内mRNA本身具有带负电荷、分子质量较大和易降解等性质，虽然mRNA疫苗不借助载体可直接注射到体内，但只有少量的mRNA可进入细胞[10]。大多数mRNA疫苗借助载体进入细胞，脂质体载体、聚合物载体、多肽载体和病毒样粒子载体等多种载体得到研究与应用，其中属于脂质体载体的脂质体纳米粒子(lipid nanoparticles,LNPs)是应用最广的mRNA疫苗载体[5,8]。LNPs在mRNA疫苗体内传递和诱导免疫反应中发挥了重要的作用，同时也是mRNA疫苗研发的难点。LNPs通常包被mRNA分子数量较少，mRNA与可电离阳离子脂质结合并位于颗粒核心，具有脂质双分子层的结构，并且在体内生物安全性较高[11]。LNPs成分较为复杂，包括可与mRNA结合的可电离阳离子脂质，与细胞膜脂类相似的磷酯，稳定LNPs脂质双分子结构的胆固醇，减少非特异性蛋白吸附和LNPs聚集的聚乙二醇-磷酯等物质[12]。

当mRNA疫苗注入机体时，mRNA-LNPs复合物首先被免疫细胞吞噬并形成内体。在免疫细胞中，mRNA-LNPs复合物在酸化降解时同时被负离子化，有助于促进mRNA从内体逃逸到细胞质中，磷脂在此过程中发挥了重要作用[13]。mRNA疫苗在细胞质中，借助细胞内的翻译系统翻译产生抗原目的蛋白(即免疫原)，部分抗原在细胞内被识别，加工后与MHCⅠ类分子结合并递呈至细胞表面。此外，部分抗原分泌到细胞外，并再次被抗原递呈细胞吞噬，经加工后与MHCⅡ类分子结合并递呈至细胞表面。免疫原经不同的途径被处理后与MHC分子结合，诱导B淋巴细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞产生特异性体液免疫和细胞免疫[14]。

mRNA疫苗中的mRNA，saRNA复制产生的双链RNA等成分，可被细胞内不同的模式识别受体识别，并激活Ⅰ型干扰素途径等先天性免疫机制，刺激机体产生大量细胞因子[15]。激活的Ⅰ型干扰素途径可促进抗原递呈细胞成熟，在诱导产生特异性免疫反应中发挥关键作用；但Ⅰ型干扰素途径也会导致外源mRNA或saRNA大量降解，并影响外源蛋白质翻译，阻碍mRNA疫苗产生良好的免疫效果，甚至出现免疫耐受现象[14,16]。mRNA疫苗可诱导产生记忆性B淋巴细胞和长寿浆细胞，实现持久的保护性细胞免疫和体液免疫反应，且mRNA疫苗诱导产生的免疫反应以Th1型免疫反应为主，而不是以可能会导致抗体依赖性增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)的Th2型免疫反应为主。

3 mRNA疫苗的优点

mRNA疫苗具有免疫效果好、研发周期短、便于大规模生产等优点，被称为新三代疫苗[18-19]。经典疫苗包括弱毒疫苗、灭活疫苗等传统疫苗，和亚单位疫苗、基因工程疫苗、重组载体疫苗等新型疫苗，在我国动物疫病防控中得到广泛的应用。mRNA疫苗与经典疫苗相比，具有以下优点：一是研发速度快，获知目的蛋白序列或编码基因后，mRNA疫苗的设计与研发仅需不到1周的时间，生产周期较经典疫苗也大为缩短，特别适用于新发病防控。二是安全性高，mRNA疫苗不产生子代病毒或细菌，不具有感染性，并且mRNA疫苗不进入细胞核，不存在整合到基因组的风险。三是免疫保护效果好，mRNA疫苗在体内本身具有免疫佐剂反应，可诱导体液免疫和细胞免疫，并产生记忆性免疫反应[17]。四是生产方便，生产mRNA疫苗需要多种工程菌和载体，不需要鸡胚或培养真核细胞，方便大量生产，且生产成本低[20]。

4 动物传染病mRNA疫苗研究进展

在动物疫病mRNA疫苗研究方面，多种疫苗在动物试验中显示良好效果，尤其是病毒病的mRNA疫苗免疫保护效果较好，可诱导动物产生特异性抗体，并在攻毒试验中有效的保护了免疫动物。但动物疫病mRNA疫苗种类较少，目前mRNA疫苗主要面向人兽共患病而研制，仅针对动物疫病的疫苗较少。此外，与病毒相比，细菌和寄生虫结构和致病过程更复杂，单一抗原难以提供有效保护，细菌病和寄生虫病mRNA疫苗有待更深入的研究。

4.1 流感病毒

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是禽流感的病原，可感染鸟类及多种哺乳动物，根据血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)来划分流感病毒亚型，目前在已发现18个HA亚型与11个NA亚型，AIV易发生变异或重组，每年给畜牧养殖业和公共卫生安全造成巨大损失。流感病毒mRNA疫苗研究较为充分，多种疫苗具有良好的免疫保护效果，可激活机体的CD4+和CD8+T淋巴细胞，并已经进入临床试验阶段，可保护同源或异源AIV的攻击[21]。Magini D等基于H1N1型禽流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白1(M1)基因序列分别构建了表达流感病毒NP(SAM(NP))、M1(SAM(M1))及NP和M1(SAM(M1-NP))的LNPs-saRNA疫苗，动物试验表明，这些疫苗单独或联合使用均可诱导机体产生中和抗体；使用H1N1和H3N2型流感病毒进行攻毒试验发现，SAM(NP)和SAM(M1-NP)可有效保护试验动物[22]。Chahal J S等[23]构建了能表达H1N1型流感病毒HA蛋白的LNPs-saRNA疫苗，动物试验验证，小鼠免疫1次该疫苗即可获得对H1N1型流感病毒感染有效的免疫保护。

4.2 狂犬病病毒

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的一种发病后病死率高达100%的烈性传染病，导致全球每年约有50 000人死亡。Saxena S等构建了表达狂犬病病毒G蛋白的saRNA疫苗，10 mg该疫苗可诱导小鼠产生类似于DNA疫苗诱导的细胞免疫和体液免疫反应，并在攻毒试验中可有效保护小鼠[24]。Stitz L等[25]构建了表达狂犬病病毒G蛋白的普通mRNA疫苗，该疫苗具有较好的热稳定性，低温条件下(-80、5、25 ℃)保存12个月，高温条件下(40、60、70、80 ℃)保存3个月，可诱导产生有充足保护效力的中和抗体；疫苗在4 ℃和56 ℃间进行20次循环存储，疫苗的免疫原性和保护性不受影响；动物攻毒试验表明该疫苗可有效保护小鼠；人体Ⅰ期临床试验结果显示，71%测试者(32/45)通过皮下注射80 μg或160 μg疫苗，46%测试者(6/13)通过无针注射装置肌肉注射200 μg或400 μg疫苗，可诱导产生有充足保护效力的中和抗体。

4.3 口蹄疫病毒

口蹄疫(Foot-and-mouth disease)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的可感染猪、牛、羊等偶蹄动物的传染病，给全世界养殖业造成了严重的损失。Pulido M R等使用FMDV基因组转录产生的mRNA接种小鼠，小鼠分为4组，一组为对照组，其余3组小鼠分别10、50、100 μg/只的剂量接种，其中多只小鼠产生了高滴度的FMDV中和抗体；随后的攻毒试验显示，3/8接种mRNA疫苗的小鼠得到了有效保护[26]。

4.4 日本脑炎病毒

日本脑炎(Japanese encephalitis)是人兽共患病，病原为日本脑炎病毒(JEV,也称乙型脑炎病毒)，在许多亚洲国家造成了儿童脑炎，感染猪可导致公猪生产性能下降和母猪流产。Huang Y T等[27]在日本脑炎病毒复制子载体(SRIP)中插入肠道病毒71型SP70蛋白编码基因，构建了mRNA疫苗SRIP-SP70；使用小鼠进行免疫和攻毒试验发现，该疫苗可有效保护小鼠免受日本脑炎病毒和肠道病毒71型的致死性攻击。

4.5 其他病毒

Powassan病毒(POWV)是一种蜱传黄病毒，该病毒首先从1名死于脑炎的儿童大脑组织中分离，目前被检测出在北美洲和俄罗斯鹿群和蜱虫中存在。Van Blargan L A等基于POWV的M蛋白前体和E蛋白编码基因设计了LNPs-mRNA疫苗，使用小鼠进行动物试验发现，该疫苗可诱导小鼠产生中和抗体，细胞试验证明中和抗体对多种黄病毒有中和作用；攻毒试验发现，免疫小鼠可经受POWN和Langat病毒致死剂量的攻击[28]。

4.6 弓形虫病

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是可感染多种动物和人类的寄生虫，全球约1/3人口因食用被污染的食物而感染，对人间最严重的危害为导致孕妇流产或胎儿缺陷。Chahal J S等[23]使用弓形虫6种特异性抗原编码基因构建了LNPs-saRNA疫苗，该疫苗可诱导小鼠产生中和抗体；攻毒试验显示，免疫小鼠攻毒后长达6个月内不表现临床症状。Luo F等[29]使用弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)蛋白编码基因构建了LNPs-saRNA疫苗，该疫苗可诱导小鼠产生中和抗体；攻毒保护试验显示，免疫小鼠存活时间延长且脑内弓形虫量减少至对照组的46.4%，并增强了对急性和慢性弓形虫感染的保护力。

4.7 细菌

Maruggi G等[30]分别构建了表达化脓性链球菌(GAS)SLOdm蛋白和无乳链球菌(GBS)链球菌BP-2a蛋白的saRNA疫苗，动物试验表明，这两种疫苗都可诱导产生免疫小鼠中和抗体，并有效的保护小鼠。Tameris M D等评价了通常用作卡介苗佐剂的结核杆菌mRNA疫苗MVA85A在临床上对婴儿的安全性、免疫原性和保护效果，开展的临床Ⅱ期试验共计对2 797名婴儿注射MVA85A疫苗或安慰剂，结果显示该疫苗具有良好的安全性，单独使用也可诱导产生保护性抗体[31]。

5 展望

新冠疫情期间，灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、亚单位疫苗和mRNA疫苗等多种疫苗被紧急研发应用，mRNA疫苗作为新一代疫苗在传染病防控中发挥了重要作用。多种mRNA疫苗紧急研制并在临床上快速应用，显示出该疫苗在应对新发疫情中具研制速度快、安全性高、保护效果好等优点[32]。临床数据显示接种第一针疫苗后，mRNA疫苗在保护率和诱导产生的中和抗体滴度上优于灭活疫苗，虽然接种第二针后，灭活疫苗也可起到良好的保护作用[33]。在保护效力方面，各种疫苗在不同国家开展的临床试验和使用数据统计显示，mRNA疫苗保护效力为91.3%～95.3%，较灭活疫苗(49.6%～83.5%)、腺病毒载体疫苗(66.1%～91.4%)、亚单位疫苗(55.4%～89.7%)保护效力高[34]。目前，艾滋病病毒(HIV)、埃博拉病毒(EBOV)、寨卡病毒(ZIKV)等多种病毒病mRNA疫苗已进入临床试验阶段[35]。

相对于目前在动物防疫中广泛应用的疫苗，mRNA疫苗还存在成本高、运输保存困难、产品少等缺点，并且相关产品存在一定安全风险，限制了它的推广和应用。相关的研究和改进集中在增强疫苗靶向性，提高产品稳定性，增加蛋白质翻译量，减少炎症反应，降低生产运输成本等多方面。将来新的mRNA疫苗会不断出现，与灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗等在动物疫病防控及净化中共同发挥重要作用。