荧光免疫层析技术在毛发样本吗啡检测中的应用

喻洪江，孔庆波*，方少华

(1.重庆警察学院，重庆 401331；2.浙江东方基因生物制品股份有限公司，浙江安吉 313300)

目前，研制一种灵敏度和准确性高、简便快捷的毒品滥用检测方法，一直是毒品滥用防控领域关注的重点问题之一。检测滥用麻醉品主要有两个目的，即甄别和确证，而不同的目的，往往选择不同的检测方法。甄别，也称初步检测，常被用于大批量分析多个样品，主要是根据所选择的某种麻醉品的临界浓度，提供初步的定性分析结果，检测结果预示了该种麻醉品的存在与否。这种检测方法和器具一般要具备设计简单、使用便捷、灵敏性高以及检测场所条件要求不高等特点。确证，即准确证明某种麻醉品的存在，是对指定麻醉品更专门的分析。确证检测方法的化学原理一般不同于甄别方法，可以选择的方法有气液层析法(GLC)、高效液相色谱法(HPLC)以及气相色谱/质谱分析法(GC/MS)等[1]。但困扰毒品现场快速检验领域的国际性难题和关键技术是检测时间窗口期偏短、检测准确性不高、血液和尿液等检材采集不够便捷等问题。有鉴于此，依据对检测准确性、时效性、便捷性和样本储存的需求，将荧光标记技术和传统免疫层析技术相结合，建立一种采用毛发作为检测吗啡样本的时间分辨荧光免疫层析技术，有望实现毒品分析的现场快速检测方法。

1 吗啡毛发荧光免疫检测试剂盒

1.1 最低检测浓度

由浙江东方基因生物制品股份有限公司研制的吗啡毛发检测试剂盒(荧光免疫层析法，生产许可证编号：浙食药监械生产许20120108号)，采用高度特异性的抗体抗原反应及荧光免疫层析技术，通过抗体竞争结合毒品偶联剂和毛发中可能含有的毒品的原理，结合配套仪器的使用可以定性和定量的检测毛发样本中是否含有吗啡待测物，根据公安部2018年发布的《涉毒人员毛发样本检测规范》规定的阳性检测临界浓度标准，毛发中吗啡的最低检测浓度定为0.2 ng/mg。

1.2 检测原理

荧光免疫层析技术以固定有检测线(包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，以测试液为流动相，荧光标记抗体固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。检测时，毛发标本在毛细效应下向上层析会出现两种显示结果：如是阴性，毛发样本与荧光抗体不结合，荧光抗体与特定毒品偶联剂结合，配套仪器检测结果为阴性；如是阳性，则毛发样本的毒品与荧光抗体先发生反应，当毛发样本中的毒品含量达到一定量时，荧光抗体就不再与测试区的特定毒品偶联剂结合，配套仪器检测结果为阳性。

1.3 定量检测反应体系及试剂主要成分

1.3.1 定量检测反应体系 反应体系如图1所示。吗啡毛发检测试剂盒，采用高度特异性的抗体与毒品偶联剂反应及免疫层析分析技术，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区(T)的特定毒品偶联剂和结合垫(聚酯膜)上的荧光标记抗体。当将样品滴加在加样区时，样品中的待测物与结合垫中的荧光微球标记抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，剩余的荧光微球标记抗体与检测线上的抗原结合。因此，检测线(T线)上结合的荧光微球标记抗体与样品中待测物的量成反比，质控线(C线)结合的荧光标记物与样品中待测物的量无关，其他荧光标记物继续层析达到吸收区。层析结束后，采用荧光读数仪的读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过ID卡(用于识别和存储标准曲线)内置标准曲线即可计算出样品中待测物的基本含量，再通过仪器内置的阴阳性判定标准来判断待测样品的阴阳性。

图1 试剂盒反应体系示意图

1.3.2 试剂主要成分 主要组成包括包被用吗啡抗原、标记用吗啡抗体、羊抗兔多克隆抗体、兔IgG、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜等。

2 配套的检测仪器

2.1 毛发毒品痕量快速分析仪

根据时间分辨荧光免疫层析技术原理，如浙江东方基因生物制品股份有限公司与重庆警察学院联合研制生产了配套仪器——毛发毒品痕量快速分析仪，型号规格为OG-G200。

2.2 配套检测仪器工作原理

以荧光标记特异性抗体作为荧光指示剂的新型荧光免疫层析技术。分析仪内置激发波长为365 nm的LED光源，荧光微球受激发后发射610 nm的荧光，通过光电转换器将检测线和质控线上的荧光信号转化为电信号，然后通过每批次ID卡上的标准曲线信息自动计算浓度，判断阴、阳性，并呈现在仪器的显示屏上。

3 毛发样本的采集及检测

依据公安部《涉毒人员毛发样本检测规范》提取毛发样本时，工作人员应当佩戴一次性手套，使用医用剪刀或者锯齿剪刀紧贴被提取人员头皮表面剪取头顶后部(如头顶后部无法提取到足够头发的，可选择离该部位最近的头部部位)长度为3 cm以内的头发；长于3 cm的头发，需从发根端截取3 cm，提取的毛发样本应当分为A、B两份，每份样本重量不少于50 mg，用铝箔纸包裹，分别装入纸质信封后将信封封装。

3.1 毛发样本的处理

3.1.1 称量 称取10 mg样本毛发(约3 cm的毛发20根)。

3.1.2 研磨 用镊子将毛发放入研磨管中，使用专用研磨仪研磨2 min。

3.2 配套仪器检测

3.2.1 准备 打开配套荧光免疫分析仪。

3.2.2 读取ID卡 确认ID卡与试剂的批号是否匹配，无误后插入ID卡，在进入测试界面点击读ID卡，读取完成，即可检测毛发样本试剂。

3.2.3 选择 在仪器界面上的样本类型中选择“毛发”。

3.2.4 裂解 将毛发裂解液加入已研磨好毛发的研磨管中，盖紧瓶盖，振荡混匀裂解1 min。

3.2.5 加样 用滴管吸取毛发裂解液的上清液，滴加3滴在试剂板的加样孔中。

3.2.6 读数 试剂卡(吗啡毛发检测试剂盒)加样后机外反应3 min，反应结束后立即将试剂卡插入仪器中，点击“测试”按钮，系统将自动读卡并给出测试结果，超过5 min后读取的结果为无效。

3.3 检测结果的解释

3.3.1 阳性(+) 界面出现结果显示为阳性，阳性结果表明毛发中药物浓度在0.2 ng/mg以上。

3.3.2 阴性(-) 界面出现结果显示为阴性，阴性结果表明毛发中药物浓度在0.2 ng/mg以下。

3.3.3 无效 当检测时出现“C线异常”，表明不正确的操作过程、试剂已变质损坏或者线位不匹配。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。

3.4 检测注意事项

3.4.1 毛发样品采集 贴紧头皮剪取，将采集的头发平放于清洁纸袋或自封袋中。

3.4.2 器械消毒 用镊子夹取头发前，需用酒精棉片擦拭干净，避免交叉污染，影响实验结果。

3.4.3 勿重复使用 本试剂盒(测试卡)为一次性使用体外诊断试剂，请勿重复使用。

3.4.4 注意自身防护 在收集、处置、储存、混匀样本和检测过程中应采取适当的保护措施。

3.4.5 试剂盒要完整 试剂盒(测试卡)在使用前请不要开封，不要使用有明显损坏的试剂盒、包装有破损的测试卡。

3.4.6 试剂和ID卡使用要匹配 不同批号的试剂不能混用，ID卡与试剂盒(测试卡)不得混批号使用。

3.4.7 使用配套仪器 试剂盒(测试卡)及其组件仅适用于配套的毒品痕量快速分析仪。

3.4.8 注意损坏仪器或污染 切勿把表面被其他液体沾湿的试剂盒(测试卡)插入检测仪，否则会污染或损坏仪器；用过的试剂盒(测试卡)请妥善处理，不要随意丢弃。

3.4.9 温度要求 应避免实验环境温度过高，低温保存的试剂盒(测试卡)需要恢复至室温后再打开，以免吸潮。

3.4.10 规范仪器操作 试剂盒(测试卡)和配套毒品痕量快速分析仪在使用时应避开颤动和电磁环境：在正常使用中仪器本身颤动属正常现象；检测进行时请勿拔出ID卡。

3.4.11 检测时间要求 为保证准确的检测结果，试剂盒(测试卡)的机外反应时间应控制在3 min，超过5 min后读取的结果无效。

3.5 样本检测

根据“国家安全防范报警系统产品质量监督检验中心(上海)”和“公安部安全防范报警系统产品质量监督检验测试中心”共同认定并发布的检验检测报告(报告编号：公沪检202143306)：通过吗啡检测限实验，吗啡毛发检测试剂盒(荧光免疫层析法，生产许可证编号：浙食药监械生产许20120108号)配合专用的毛发毒品痕量快速分析仪(型号规格为OG-G200)，在检出率不小于90%的前提下，在进样量为80 μL时，对浓度为2 ng/mL(2 ng/mL相当于0.2 ng/mg)的吗啡毛发样品进行采样分析，检测限应≤0.16 ng/mg。

4 免疫荧光技术优势与局限性

4.1 目前常用吗啡检测技术

吗啡(morphine)为阿片受体激动剂，分子式为C17H19NO3，分子质量为285.3 u，它具有强大的镇痛作用，对一切疼痛均有效，同时具有较强的药物成瘾性，一般连续使用1至2周即可出现耐受性，滥用剂量是普通治疗量的20至200倍[2]。其分子结构式见图2所示。

图2 吗啡分子结构式示意图

目前，检测吗啡的技术主要有：①实验室理化检测法，如化学反应、物理识别等。此类方法优点是反应速度快；缺点是与免疫法比较灵敏度差、精确度差、步骤较复杂等②免疫法，如ELISA、胶体金、荧光、化学发光等。此类方法具有反应速度快、灵敏度高、成本低、方便携带等优点，是目前国际通用的筛查方法。③色谱法，如气相层析法、气相色谱/质谱分析法(GC/MS)、液相色谱/质谱分析法(LC/MS)等。此类方法优点是检测灵敏度高；缺点是成本高、操作复杂、需要专门仪器等。④光谱法，如原子光谱、分子光谱(拉曼光谱)等。

4.2 荧光免疫技术的优势

免疫层析技术(immunochromatographic assay，ICA)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性强、操作简单、检测速度快等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域[3]。这种传统免疫层析技术是以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析，方法虽然简单快速，但灵敏度较差，难以准确定量。而荧光免疫层析技术作为一种新型免疫检测技术，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一[4]。荧光免疫层析法的建立，是基于时间分辨荧光免疫层析技术，而时间分辨荧光免疫层析技术是基于荧光标记技术和免疫层析技术相结合发展创新的一种抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度[5]。其原理是：对于只具有单一抗原表位的待测小分子抗原(如违禁药物、农药、兽药等)与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗原结合，是一种竞争抑制免疫层析法。此种方法大多用来检测具有单一抗原表位的小分子待测物，见表1所示。

表1 主要查毒方法优缺点比较

荧光与抗体标记技术的应用优势使用的标记方法是化学偶联，即抗体上的氨基(-NH3)和荧光上的羧基(-COOH)脱水缩合[6]。这种标记方法具有以下优点：①标记过程反应温和，标记后的抗体高活性、高结合率；②无需复杂的设备进行纯化；③重复性可控，批间差小；④标记后抗体稳定，可大批量标记生产、保存。

4.3 荧光免疫技术的局限性

荧光与抗体标记技术只能用于初筛检测，检测结果目前不作为确认药物滥用的依据，下一步将与气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等确证分析方法做对比研究试验，以确认其使用灵敏度和特异性的水平。

另外，易造成假阴性或假阳性。造成假阴性结果的原因主要有：服用吗啡药物时间尚短，药物还未代谢至毛发中，导致结果未检出[7-8]；毛发研磨不充分或者反应时间过长或过短等操作不正确因素；运输及储存不当使试剂或裂解液失效等。造成假阳性结果的原因主要有：服用某些常用药物或食用某些食物所致等(例如服用可待因类药物时会导致吗啡检测假阳性结果)。另外，配套仪器参数的设置问题，也是影响试剂检测结果的主要因素。

5 方法的创新及应用

5.1 时间分辨荧光标记技术

镧系元素荧光标记技术时，当镧系元素荧光被激发后，在固定时间段检测特异性荧光，而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0。理论上1 ms为1个周期，1 s可重复测量1 000次，后取平均值，使值更准确。

5.2 高效毛发裂解液

使用独创的裂解毛发生物品的复合配方试剂，将毛发剪成1 cm～2 mm小段(或者采用研磨形式)，直接加入裂解液，反应1 min，以提高毒品毛发样本的裂解效率。

5.3 稳定的缓冲体系

为了消除、降低个体样本之间的基质、pH差异，需对缓冲液的pH、离子强度和功能性物质(表面活性剂、大分子物质、惰性蛋白和小分子保护物质)的添加进行系统研究，最终确定产品的缓冲体系。

吗啡毛发检测试剂盒(荧光免疫层析法)配合专用的检测分析仪器用于阿片类药物的初筛检测，具有操作简便快捷、检测要求条件低、结果稳定准确、样本不易掺假以及便于保存等优点，可有效解决毒品查缉、毒驾管控、社区戒毒人员管控、交管系统各类驾驶员吸毒筛查、专业机构吸毒筛查，以及征兵、特种行业招工吸毒筛查等过程中遇到的关键性技术难题，具有广泛的应用场景。