枸杞子标准汤剂制备及质量标准研究

黄燕明，陈桂生，李雪银，汪 静，王艳慧，康志英，2，3

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300；3.广东香雪南药发展有限公司，广东 肇庆 526600)

中药配方颗粒也称“免煎中药”，由于它具有携带方便、使用便捷的特点，已被广泛应用于临床并初步显现出较好的临床疗效。作为一种新型饮片，配方颗粒具有简便的特点，其质量问题也备受关注。为了使配方颗粒的质量评价更规范化，业界引入了“标准汤剂”这一概念。中药饮片标准汤剂也称标准煎剂，以中医药理论为指导，经标准化的现代制备工艺制备而成的单味饮片煎剂，用于衡量配方颗粒的标准参照物[1]。

枸杞子，别名红耳坠、地骨子，为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实[2]。枸杞子属于常用的滋补类中药，也是药食两用品种，具有补益肝肾、益精明目的功效，适用于有虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣等症状的人群[2-3]。查阅文献可知，枸杞子主要含有枸杞多糖、生物碱、黄酮类、氨基酸、色素、有机物酸类等化学成分[4-6]。为科学评价枸杞子配方颗粒质量，本研究通过收集15批来自不同产地的枸杞子饮片，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，结合《医疗机构中药煎药室管理规范》中药煎煮方法相关操作规范要求，分别制备成15批枸杞子饮片标准汤剂，计算出膏范围，进行指纹图谱研究，并对共有峰进行指认，建立枸杞子饮片标准汤剂质量标准评价方法，进一步为枸杞子配方颗粒质量评价提供参考依据[7-10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(安捷伦)；DV215CD十万分之一天平(Discovery)；BSA224S万分之一天平(Sartorius)；LC-20AD高效液相色谱(SHIMADZU)，连接AB-5500型三重四级杆-离子阱质谱仪(Q-Trap-MS)；配两个独立二元泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、光电二极管阵列检测器(PDA)和电喷雾离子源(ESI)。DK-80型三孔电热恒温水箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

乙腈(天津赛孚瑞，色谱纯)，甲醇(北京化工厂，分析纯)，甲酸(北京化学试剂厂，分析纯)，磷酸(西陇化工，分析纯)，超纯水。

1.3 对照品

芦丁对照品(批号：100080-201409；纯度：供HPLC 91.9%；供UV 92.6%)，购自中国食品药品检定研究院。枸杞子对照药材(批号：121072-201410)，购自中国食品药品检定研究院。绿原酸对照品(批号：110753-201817；纯度：96.8%)，购自中国食品药品检定研究院。对-香豆酸对照品(批号：112037-201801；纯度：99.3%)，购自中国食品药品检定研究院。阿魏酸对照品(批号：110773-201915；纯度：99.4%)，购自中国食品药品检定研究院。咖啡酸对照品(批号：110885-201703；纯度：99.7%)，购自中国食品药品检定研究院。隐绿原酸酸对照品(批号：19042402；纯度：98.03%)，购自成都普菲德生物技术有限公司。新绿原酸对照品(批号：19042305；纯度：99.60%)，购自成都普菲德生物技术有限公司。

1.4 样品

本研究共收集来自3个不同产地的15批枸杞子饮片，样品经广州市香雪制药股份有限公司高级工程师康志英鉴定均为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实。饮片产地信息见表1。

表1 枸杞子饮片产地信息

2 方法与结果

2.1 标准汤剂制备

称取枸杞子饮片100 g，加水煎煮2次，第一次加12倍量水，浸泡30 min，煎煮40 min，滤过；药渣加10倍量水，煎煮30 min，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药浓度约为1∶2(g∶mL)的浸膏，冷冻干燥，即得。

2.2 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加50%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加50%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度。

2.1.3 测定法 取枸杞子冻干粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3 mL，置25 mL量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加50%乙醇至6.0 mL”起，以自身为空白，依法测定吸光度。

2.1.4 方法学考察 (1)线性关系。称取芦丁对照品(批号：100080-201409，纯度UV：92.6%)20.68 mg，置量瓶中，加50%乙醇适量使溶解，放冷，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.191 5 mg·mL-1的对照品溶液。精取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加50%乙醇至6.0 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加50%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应溶剂为空白，在510 nm的波长处分别测定吸光度，绘制标准曲线。回归方程：Y=12.881 5x+0.038 131 4，相关系数：r=1.000 0。结果表明，芦丁在0.007 66～0.045 96 mg·mL-1范围内线性良好。

(2)准确度试验。取枸杞子标准汤剂冻干粉，批号：200101，总黄酮含量以芦丁计为0.813%。采用加样回收法，精密称取芦丁对照品47.96 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙醇超声溶解，取出，放冷，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.888 2 mg/mL的对照品溶液。分别取6份枸杞子标准汤剂约0.5 g，精密称定，分置具塞锥形瓶中，精密量取上述芦丁对照品溶液5 mL，再精密加入50%乙醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取上述续滤液3 mL，置25 mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50%乙醇至6.0 mL”起，依法测定吸光度。结果总黄酮平均回收率为102.39%，RSD为0.79%，表明本方法准确度较好。

(3)样品测定。取15批枸杞子冻干粉依法测定，计算总黄酮的转移率和出膏率，结果见表2。

表2 15批枸杞子标准汤剂总黄酮含量与出膏率测定结果 (%)

2.3 指纹图谱研究

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序见表3；检测波长为330 nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于10 000。

表3 洗脱程序

2.3.2 参照物溶液的制备 取枸杞子对照药材约3 g，加水50 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加入80%乙醇50 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水适量溶解，加在聚酰胺柱上(60～100目，内径1.5 cm，高5 cm，用水处理至中性)，先用水150 mL洗脱，弃去水液，继用30%乙醇溶液100 mL洗脱，弃去30%乙醇液，再用50%乙醇溶液100 mL洗脱，收集50%乙醇洗脱液，浓缩至适量，转移至2 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取芦丁对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取枸杞子冻干粉约6 g，置具塞锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水适量溶解，加在聚酰胺柱上(60目～100目，内径1.5 cm，高5 cm，用水处理至中性)，先用水150 mL洗脱，弃去水液，继用30%乙醇溶液100 mL洗脱，弃去30%乙醇液，再用50%乙醇溶液100 mL洗脱，收集50%乙醇洗脱液，浓缩至适量，转移至5 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 样品检测结果 取15批枸杞子冻干粉，依法制备供试品溶液并测定，得到15批枸杞子标准汤剂的色谱叠加图(见图1)，生成对照指纹图谱(见图2)。采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012.1版)》对15批样品的色谱图进行分析，相似度大于0.90。以相对保留时间稳定性好且各批次样品均有检出为原则，选出5个共有峰。

图1 15批标准汤剂HPLC叠加图

注：峰1：绿原酸；峰2：隐绿原酸；峰3：对-香豆酸；峰4：阿魏酸；峰5(S)：芦丁。

2.3.5 方法学考察 (1)精密度试验。取同一供试品溶液(批号：200101)，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，每次10 μL，记录图谱。所得图谱按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》对其相似度进行计算，结果相似度均在0.98以上，RSD为0.00%，表明仪器精密度良好。

(2)重复性试验。分别称取6份枸杞子冻干粉(批号：200101)，按供试品溶液制备和测定法项下进行操作，记录图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》评价，结果图谱相似度均在0.98以上，RSD为0.31%，表明该方法的重复性良好。

(3)稳定性试验。取同一份枸杞子标准汤剂供试品溶液，放置0、2、4、6、8、12、24h后进样分析，记录图谱。各图谱相似度评价均在0.98以上，RSD为0.04%，说明供试品溶液在放置24 h内稳定性良好。

(4)耐用性试验。考察不同流速(1.0 mL·min-1、1.1 mL·min-1、1.2 mL·min-1)、不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同色谱柱对本色谱条件的耐用性，所得图谱分别以共有峰计算相似度，结果不同色谱柱、不同流速、不同柱温条件下测定结果差异不大，色谱图中各共有峰峰型尖锐、对称，分离度良好，相似度均不低于0.90，RSD均<3%。表明本方法不同色谱柱、不同流速、不同柱温条件下耐用性良好。

2.4 共有峰指认

采用HPLC-Q-TOF-MS法确认枸杞子标准汤剂共有峰的化学结构。

2.4.1 供试品溶液的制备 同“2.3.3”项下供试品溶液制备方法。

2.4.2 色谱分离条件 同“2.3.1”项下的色谱条件。

2.4.3 质谱条件 分别在正、负离子模式下进行检测，干燥气温度设定为600 ℃，干燥气流速为35 L/min，雾化气压力60 psi，毛细管电压5 500 V(正模式)和4 500 V(负模式)，祛簇电压100 V。一级质谱选用EMS模式，质量扫描范围50～1 000m/z。二级质谱选用EPI模式，碰撞电压30 eV。

2.4.4 质谱分析与结果 精密吸取枸杞子标准汤剂供试品溶液注入LC-MS仪，按上述条件进行检测，根据枸杞子标准汤剂供试液的HPLC-UV色谱图(见图3)和HPLC-QTrap-MS总离子流图，9个色谱峰物质均得到了良好的分离和检测。枸杞子标准汤剂指纹图谱中9个色谱峰的一级、二级质谱分析结果见表4[11-16]。

图3 枸杞子标准汤剂供试液的HPLC-UV色谱

表4 一级和二级质谱分析结果

续表4

根据质谱检测结果，结合参考文献进行比对分析，确认9个色谱峰的化学结构，依次为绿原酸、隐绿原酸、对-香豆酸、阿魏酸、芦丁、新绿原酸、咖啡酸、1，3，5-三咖啡酰奎宁酸、3，4，5-三咖啡酰奎宁酸，其中峰S3和峰S4互为异构体(1，3，5-三咖啡酰奎宁酸/3，4，5-三咖啡酰奎宁酸)。在研究中笔者发现，峰S1～S4在多批次中波动较大，故不定为共有峰。

3 讨论

枸杞子的活性成分主要含有多糖、黄酮类，其中黄酮类已知成分主要有芦丁等，所以指纹图谱中供试品制备方法考察中考虑聚酰胺柱处理的方法。本试验还分别考察不同内径层析柱及聚酰胺用量(内径1 cm，高20 cm；内径1.5 cm，高10 cm；内径1.5 cm，高5 cm)对图谱的影响，结果发现层析柱不同内径及聚酰胺用量均无较大区别。从节省时间角度考虑，供试品制备方法采用聚酰胺柱(60～100目)，内径1.5 cm，高5 cm，用水处理至中性。

本研究通过制备15批枸杞子标准汤剂，并进行总黄酮含量检测，计算转移率和出膏率，同时建立其指纹图谱检测方法，并进行方法学考察。其中总黄酮含量测定方法学线性良好，准确度试验RSD小于3%；指纹图谱精密度、稳定性、重复性、耐用性试验RSD亦均小于3%，表明两个方法均稳定可行，可作为枸杞子标准汤剂质量评价方法，同时为枸杞子配方颗粒质量评价提供参考。