7个指标的微波酒制白屈菜炮制工艺研究

黄 爽，李瑞海，贾天柱

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

白屈菜ChelidoniummajusL.是一种属全草类的罂粟科植物[1]，俗称山黄连、断肠草等。白屈菜药性凉、苦，有小毒，归肺经、胃经[2]，常用于解痉止痛、镇咳平喘[3]。白屈菜中富含的原阿片碱、别隐品碱等生物碱类活性成分是其发挥治疗作用的主要因素[4]。目前，对白屈菜饮片炮制方法的研究报道较少，除净制外，还有研究者对其进行了醋制以达到减毒增效的效果[5]。本研究对白屈菜进行酒制炮制，结果发现，经酒制，白屈菜生品中难容于水、难煎出的游离型生物碱煎出量均有提升。传统中药材酒制法对操作者在炮制过程中的火力及时间掌控能力要求较高，在炮制过程中易出现火力过猛，时间过长，造成药材煎糊，或火力过小，炮制时间不足导致含水量过高等问题[6]。因此，本研究将工艺可控的微波技术引入白屈菜酒制炮制中，以弥补传统酒制不足。本研究采用正交设计法，以白屈菜中别隐品碱等7种生物碱总量为评价指标，优选白屈菜微波酒制炮制最佳工艺，为白屈菜饮片的进一步炮制奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

P230Ⅱ依利特高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；P70F23P-G5(SO)微波炉(广东格兰仕微波生活电器制造有限公司)；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；FDV 超细粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司)；FA1004 精密电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)与购自金坛市白塔新宝仪器厂的HH-W600 数显三用恒温水箱。

1.2 试药

辽宁中医药大学药学院王荣祥教授鉴定本研究所用白屈菜为产自广西的罂粟科全草类植物白屈菜；古越龙山15%vol黄酒(中国绍兴黄酒集团有限公司)；白屈菜碱 Alk3 (Chelidonine，YZ180424，>99.9%，南京源植物生物科技有限公司)；大连美仑生物技术有限公司供应以下标准品：原阿片碱 Alk1 (Protoopine，20170612，99.5%)、别隐品碱 Alk2 (Allocryptopine，20160918，99.1%)、盐酸黄连碱Alk4 (Coptisine hydrochloride，20170719，98.2%)、血根碱Alk5 (Sanguinarine，20140717，99.6%)、小檗碱 Alk6 (Berberine，20160907，99.5%)和白屈菜红碱Alk7 (Chelerythrine，20170103，98.1%)；乙腈(国药集团)；超纯水及盐酸等试剂。7个生物碱碱极性大小：原阿片碱>别隐品碱>白屈菜碱>盐酸黄连碱>血根碱>小檗碱>白屈菜红碱。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 配制对照品溶液 取Alk1、Alk2、Alk3、Alk4、Alk5、Alk6和Alk7对照品，以甲醇为溶剂制成0.037 1、0.053 6、0.025 9、0.061 8、0.027 4、0.044 6、0.026 0 mg/mL的混合对照品溶液备用。

2.1.2 配制供试品溶液[7-9]精密称取白屈菜粉末2 g(粉碎并过60目筛)，置150 mL锥形瓶中，55 ℃下乙醇超声提取 60 min (50 mL，200 W，40 kHz)。滤过得提取液，蒸干，加 100 mL 0.4%盐酸浸泡，静置过夜。隔夜后将浸泡液及残渣移至125 mL量瓶中，50 ℃下超声30 min。抽滤并取续滤液50 mL，用2.71 mol/L 的NaOH溶液调pH值至11，静置30 min(室温)，加40 mL氯仿萃取3次，合并氯仿层，合并蒸干氯仿层，以甲醇为溶剂，定容至10 mL 容量瓶中，过滤备用(0.45 μm微孔滤膜)。

2.2 色谱条件[8-10]

选用规格为(4.6 mm×250 mm，5 μm)的Kromasil ODS-C18中汇达分析柱；选择的流动相为(A)0.1%三乙胺溶液(pH=3)-(B)乙腈；选用0～18 min，24%B；18～32 min：24%B→35%B条件进行梯度洗脱；设置检测波长为274 nm；流速调节为2 mL/min；柱温调至30 ℃；每次进样20 μL。

2.3 专属性试验

精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，并在上述色谱条件下进行检测，如图1所示，对照品分离度良好，无干扰峰。

2.4 线性关系考察

精密吸取含0.218 mg/mL Alk1、0.0536mg/mL Alk2、0.063 mg/mL Alk3、0.187 mg/mL Alk4、0.017 mg/mL Alk5、0.019 mg/mL Alk6和0.020 4 mg/mL Alk7的混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL，以甲醇为溶剂，分别将各对照品溶液定容至25 mL容量瓶中，测定各个混合对照品的色谱峰面积(同“2.2”项条件)，绘制标准曲线[X(进样量/μg)，Y(峰面积)]，回归方程及线性范围见表1。结果表明，7种对照品溶液线性关系良好。

表1 回归方程及线性范围

注：1：Alk1；2：Alk2；3：Alk3；4：Alk4；5：Alk5；6：Alk6；7：Alk7。对照品(A)；白屈菜药材(B)。

2.5 精密度试验

精密吸取7种对照品溶液，分别测其峰面积RSD(n=6)为2.09%、2.39%、0.58%、1.46%、1.56%、1.97%、1.11%，说明方法精密度良好。

2.6 重复性试验

取白屈菜1号(20201222)样品，分别精密称取2 g，按“2.1.2”项方法配制供试品溶液，按“2.2”项条件进样测定，结果原阿片碱、别隐品碱、白屈菜碱、盐酸黄连碱、血根碱、小檗碱、白屈菜红碱的含量分别为0.394 4、0.062 0、0.723 1、0.859 4、0.082 5、0.044 1、0.037 6 mg/g，RSD(n=6)分别为1.17%、1.93%、0.58%、0.17%、2.06%、1.28%、0.81%，说明方法重现性良好。

2.7 稳定性试验

取1号(20201222)供试品，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定(“2.2”项条件)，原阿片碱、别隐品碱、白屈菜碱、盐酸黄连碱、血根碱、小檗碱、白屈菜红碱的峰面积RSD(n=6)分别为1.20%、2.12%、0.70%、1.86%、2.35%、1.43%、0.86%，表明样品在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称定白屈菜粉末2 g，共6份，置于量瓶中，分别加入10 mL混合对照品溶液(含1.225 mg/mL Alk1、2.265 mg/mL Alk2、1.875 mg/mL Alk3、3.03 mg/mL Alk4、0.105 mg/mL Alk5、0.16 mg/mL Alk6和0.05 mg/mL Alk7)，配制成供试品溶液(“2.1.2”项方法)，进行HPLC测定(“2.2”项条件)，计算得各样品平均回收率分别为99.71%、99.76%、101.43%、100.29%、100.66%、98.39%和100.05%，RSD分别为0.37%、1.98%、1.87%、0.60%、1.12%、2.53%和1.89%，符合相关规定。

2.9 正交设计及含量测定结果[5-7]

本研究参考文献[5]采用焖法进行正交试验，以酒用量、焖润时间、火力大小和炮制时间为因素，各取3个水平(见表2、图2)，按照表3进行正交试验。

表2 因素水平

以总碱量进行方差分析，黄酒用量和炮制时间因素具有显著性差异(见表4)。以Alk1、Alk2、Alk3和Alk4的总量进行方差分析时，其结果与总碱为指标时结果相似。据白屈菜总碱直观分析，各因素影响顺序为A>D>C>B，最佳组合为酒用量40%，焖润1 h，60%火力下炮制3 min。据方差分析，黄酒用量和炮制时间因素差异有显著性，焖润时间和火力大小因素差异无统计学意义，酒量3水平最佳，焖润时间1水平最佳，即酒用量40%，焖润1 h，选择火力大小60%，炮制时间3 min。结合直观分析与方差分析结果，确定工艺为加酒用量40%，焖润1 h，60%微波火力下炮制3 min。

表3 L9(34)正交设计

注：总碱(A)；Alk1、Alk2、Alk3、Alk4的和值(B)。

表4 方差分析

2.10验证试验

称取白屈菜粉末3份，每份约100 g，分别加40 g黄酒拌匀，焖润1 h，60%微波火力下炮制3 min。分别按“2.1.2”项和“2.2”项进行供试品溶液配制和HPLC检测。结果表明，3份样品中7种生物碱总碱的平均含量为2.15 mg/g(n=3)，RSD为0.26%，表明优选出的微波酒制白屈菜炮制工艺可靠。

3 讨论

本研究采用多指标分组考察，以7个对照品及其总生物碱含量为指标进行数据处理，试验结果更客观，更接近实际结果，具有显著的特点。在对7个对照品分别做正交数据处理过程中发现，极性相对大的前4个生物碱，即原阿片碱、别隐品碱、白屈菜碱和盐酸黄连碱的数据变化趋势趋于一致，即焖润时间与火力大小均对其影响小，而黄酒用量和炮制时间均对其影响大，说明黄酒用量和炮制时间因素对水溶性生物碱具有显著性差异，有统计学意义。别隐品碱等4个生物碱成分水溶性相对强，由于酒的加入使更多生物碱溶出，因而可更好地发挥白屈菜的止痛功效。本研究建立的白屈菜7个成分多指标评价的HPLC含量测定方法，分离度较高，符合相关要求，较前期研究增加了别隐品碱，具有一定新意。