miR-33b、miR-3195在喉鳞状细胞癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性

王军玉 邵路军

1 河南省长垣市中医医院耳鼻喉科 453400； 2 郑州博爱眼耳鼻喉医院麻醉科

喉鳞状细胞癌为耳鼻喉外科高发恶性肿瘤，近年来喉癌发病率呈逐年上升趋势。随着手术方式不断改进与放化疗等方式辅助治疗，喉鳞状细胞癌治疗确定一定进展，但患者预后仍不佳，特别是晚期患者预后较差。故深入了解喉鳞状细胞癌发病机制，通过筛选肿瘤相关特异性标志物可为早期诊断发现肿瘤并治疗提供参考依据，为目前临床亟需解决的难题[1-2]。 微小RNA为近年来发现的非编码短序列的小RNA，长度在18～25个核苷酸，成熟miR与靶基因mRNA完全或不完全互补配对，降解或沉默靶基因，具有类似癌基因和抑癌基因作用。miR分子为早期癌症检测的标记分子，能早期诊断预测肿瘤疾病发生，对诊断喉鳞状细胞癌并判断患者预后具有重要价值[3]。microRNA为转录后水平调节编码蛋白基因表达内源性非编码RNA分子，研究显示[4]，miR-33b与miR-3195在恶性肿瘤中异常表达。为此，本研究通过对68例喉鳞状细胞癌患者癌组织与癌旁组织的miR-33b、miR-3195表达情况进行对比，并经相关性分析miR分子表达与临床病理参数关系，旨在为判断患者预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 经医院医学伦理委员会批准，回顾性分析选取长垣市中医医院2018年10月—2020年10月收治的68例喉鳞状细胞癌患者，手术取喉鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织。纳入标准：符合《口腔鳞状细胞癌时辰化疗中国专家共识》标准[5]，且手术后经病理检查确诊为喉鳞状细胞癌；术前无放化疗等抗肿瘤治疗；签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；肝肾等脏器衰竭患者；免疫系统疾病患者；传染性疾病患者；精神疾病及意识障碍患者；凝血功能障碍患者。纳入患者中男58例，女10例；年龄48～72岁，平均年龄(68.48±7.29)岁；组织分化程度：低分化21例、中分化28例、高分化19例；临床TNM分期：T1期16例、T2期20例、T3期23例、T4期9例；肿瘤类型：声门型37例、声门上型17例、声门下型14例；淋巴结转移情况：转移29例、无转移39例。

1.2 方法 (1)RNA提取：①取喉鳞状细胞癌组织与对应癌旁正常组织，于液氮下研成粉末，刮入EP管中；②管内分别加入裂解液充分混匀，于室温下静置；③管内加入氯仿，EP管上下颠倒数次，当其溶液变为乳白色后，静置10min；④使用离心机进行离心，静置，EP管内分成3层，上层液相中含有RNA；⑤将上清液移到新的EP管内，加入异丙醇，于低温下沉淀，后离心5min；⑥加入预冷乙醇，上下颠倒后离心；⑦弃除上清液干燥的RNA沉淀，加入DEPC水混匀，于室温下溶解。采用分光光度仪(上海仪电分析仪器有限公司，型号：N2S/N2)检测RNA的纯度，良好RNA的OD260/OD280位于1.8～2.0，该数值表明RNA纯度合格。(2)逆转录：①于PCR管内配置逆转录反应体系；②配置PCR体系，振荡混匀后离心，在低温冰盒上操作，管内先后加入DNA模板与引物，加入MIX体系，待无气泡产生后将PCR管放入PCR仪器中，逆转录体系中于37℃中保温使其完全反应后放置85℃中终止反应;③向体系中加入ddH2O进行稀释，放置冰箱内保存待用。(3)PCR检测：①配置反应体系；②配置PCR反应条件：95℃进行15min预变，进入循环后，于94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，对荧光进行采集，共40循环；于60～95℃下融解，内参设为U6，重复进行3次试验，采用2-ΔΔCT，ΔΔCT=(Ct目标基因-Ct管家基因)研究组-(Ct目标基因-Ct管家基因)对照组，计算相对定量法检测miR-33b、miR-3195表达量[6-7]。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0软件分析数据，计数资料以χ2检验，符合正态分布的定量资料分析采用t检验和方差分析，相关性的分析采用Spearman秩相关方法；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-33b、miR-3195表达水平比较 喉鳞状细胞癌组织中miR-33b、miR-3195表达量低于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 两组织 miR-33b、miR-3195表达水平比较

2.2 癌组织 miR-33b、miR-3195表达与临床病理特征关系 喉鳞状细胞癌组织中miR-33b、miR-3195表达量与性别、年龄无关(P>0.05)，与组织分化程度、TNM分期、肿瘤部位及淋巴转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 癌组织 miR-33b、miR-3195表达与临床病理特征关系

2.3 癌组织miR-33b、miR-3195表达与病理特征相关性分析 经Spearman相关性分析结果显示，喉鳞状细胞癌患者miR-33b、miR-3195表达与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 癌组织 miR-33b、miR-3195表达与病理特征相关性分析

3 讨论

喉鳞状细胞癌为头颈部常见恶性肿瘤，发病率在全身恶性肿瘤中占有一定比率。该肿瘤分为声门型、声门上型与下型三种类型，其中声门型最常见，男性发病率高于女性。近年来喉鳞状细胞癌发病率逐渐上升，认为该肿瘤的发生发展为多因素多步骤综合作用结果，但具体发病原因尚不明确。目前临床治疗喉鳞状细胞癌的方式有手术、放化疗、基因等治疗，患者在早期能通过多种方式进行治愈，对于晚期患者的疗效较差[8-9]。故探讨有效检测指标及预后指标以制定合理高效的治疗方法对提高患者生活质量并延长生存时间极为重要。

微小RNAs在转录后水平调控mRNA表达，但无蛋白质编码功能，长度在19～25个核苷酸，为一类单链小分子RNA，可经多种途径影响生物体生命过程。与多种长链非编码RNA相比，miRNA在人类基因组中占比较低，但部分基因可通过与miRNA结合而受其调控。研究显示，大多数miRNA位于染色体肿瘤相关部位[10-11]。随着近年来对恶性肿瘤发病相关机制不断深入研究，发现miRNA在喉鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达，说明了miRNA可能促进或抑制肿瘤发展，与其发生发展具有一定关系。miR-33b为miR-33家族成员，能调节胆固醇稳态及脂质、糖类代谢功能。有研究指出[12]，miR-33b能抑制乳腺癌细胞干细胞特性、转移与侵袭，发挥抑癌作用。在喉鳞状细胞癌中miR-33a能通过直接靶向PIM-1原癌基因3’端非翻译区发挥抗增殖功能，在多种恶性肿瘤中表达下调，为抑癌基因。miR-3195位于20号染色体的q13.33上，前体于miRBase中编号为MI0014240；成熟miR-3195于miRBase中编号为MIMAT0015079。20号染色体上microRNA与胃癌、肝癌、大肠癌等恶性肿瘤发病密切相关，进一步研究显示20q13.33与造血系统的恶性肿瘤有关[13]。芯片筛选实验结果显示[14]，喉鳞状细胞癌标本中存在较多上调或下调表达的miRNA，说明miRNA表达量变化在喉鳞状细胞癌发生发展过程中具有关键作用。本研究中基因芯片检测与PCR检测结果显示在喉鳞状细胞癌组织中miR-33b、miR-3195相对表达量均低于癌旁正常组织，可能是miR-33b、miR-3195在喉鳞状细胞癌中发挥类似癌基因的作用[14]。相对于癌旁正常组织，喉鳞状细胞癌组织中miR-33b、miR-3195相对表达量更低，且临床TNM分期越晚合并淋巴结转移患者组织中miR-33b、miR-3195表达量越低，表明miR-33b、miR-3195下调表达与肿瘤发生发展、侵袭与转移具有密切关联。患者组织中miR-33b、miR-3195表达量降低，且晚期与有淋巴结转移者表达量低于早期和无淋巴结转移患者，提示miR-33b、miR-3195表达下降，两者可参与喉鳞状细胞癌发生发展，可能是该肿瘤发生的重要机制，有待成为靶向治疗新方向[15-16]。采用Spearman相关性分析法处理患者miR-33b、miR-3195表达量与临床病理特征，结果显示两者与其呈负相关，miR-33b、miR-3195表达下调共同促进喉鳞状细胞癌发生发展[17]。

综上所述，miR-33b、miR-3195在喉鳞状细胞癌组织中呈低表达状态，且与患者临床TNM分期、淋巴结转移呈负相关，可作为评估患者病情严重程度与预后的标志物。