磷酸肌酸对糖尿病大鼠冠状动脉的保护研究

蔚俊星 党旭云

1 陕西省西安市第四医院麻醉科 710004； 2 西安医学院第一附属医院麻醉科

随着人们生活水平的提高，糖尿病人群逐年增多，临床上接受麻醉和手术的糖尿病患者也日益增加。糖尿病以损害全身血管为特点，可以累积心、脑、肾、眼及神经的病变。冠状动脉疾病作为危害人类健康的常见病，冠脉再灌疗法虽能在一定程度上减少坏死面积，改善心功能，但可引起再灌注损伤或残留术后缺血区心肌灌注不足。因此，对于糖尿病患者冠状动脉保护的研究对于改善患者预后具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 糖尿病模型的建立 40只雄性SD大鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(陕)2017-001。体重250～300g。高脂饲养4周后，按40mg/kg腹腔注射链脲佐菌素，72h后采尾血测血糖，非空腹血糖≥16.7mmol/L持续1周者确定为糖尿病。饲养8周建立本研究所用糖尿病病程8周大鼠模型。建模过程中3只大鼠死于糖尿病，2只未达到血糖标准，故成模大鼠共35只。之后，研究中2只大鼠因未完成再灌注就已死亡，1只大鼠因冠脉血管环制备失败，均剔除并补齐。

1.2 动物分组 所有成模糖尿病大鼠随机分为4组(n=8)：假手术组(Ⅰ)，开胸后只穿线不结扎LAD。MIRI+生理盐水组(Ⅱ)，结扎LAD前30min按20ml/kg腹腔注射生理盐水。MIRI+PCr单次注射组(Ⅲ)，结扎LAD前30min按2g/kg腹腔注射PCr。MIRI+PCr多次注射组(Ⅳ)，按2g/kg腹腔注射PCr，实验前5d开始，1次/d，共5次。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立 乌拉坦腹腔注射，麻醉后仰卧位固定于操作台，气管插管连接呼吸机，潮气量6ml/100g，呼吸频率60～80次/min。胸骨左侧第3、4肋间开胸器暴露心脏，在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左前降支(LAD)伴行的静脉，放置塑料管，一并进行紧密结扎。成功扎闭LAD的标准：左室前壁发绀，向外膨出，且心电图ST段抬高，T波高耸。于结扎成功30min后，拔出塑料管，再灌注2h。

1.4 冠脉血管环的制备 实验结束，迅速分离出LAD，浸入冷的Krebs液中，显微镜下剥除外周脂肪及血管周围的结缔组织，制备成2～3mm的血管环。置于盛有37℃ Kerbs液的浴槽中，通有95%O2+5%CO2混合气体，调节血管环的基础张力为2mN，平衡60min，每15min更换1次Krebs液，正式实验前需调零。以K+-Krebs液(含60mmol/L)检验动脉环收缩性，如果前后2次最大收缩幅度差<10%者，认为血管反应可重复，可开始正式实验，借助张力传感器，生理记录仪观察血管张力的变化。Kerbs液组成(NaCl 119mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 4.6mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.6mmol/L)。K+-Krebs液组成(NaCl 60mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 63.5mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.5mmol/L)。

1.5 指标测定

1.5.1 冠脉血管反应性的测定。舒张反应：平衡后，向浴槽内加入60mmol/L的KCl，待血管反应达到最大收缩峰值后，用浓度累加法加入Ach观察血管的舒张反应，依次递增使浴槽内终浓度为10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其浓度—效应曲线。再用Krebs液洗脱至基线，平衡40min后开始下一轮实验。舒张反应的变化用舒张率表示=不同浓度Ach引起的松弛数/预先使用KCl引起的血管收缩数值×100%。

收缩反应：待血管稳定后，向浴槽内加入60mmol/L的KCl，3min后用Kerbs液洗脱，再用浓度累加法加入5-HT收缩血管，依次递增使浴槽内终浓度为10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其累加浓度—效应曲线。收缩反应的变化用收缩率表示=不同浓度5-HT引起的张力/预先使用KCl引起的血管收缩数值×100%。

1.5.2 电镜结果。实验结束后，立即将LAD置于浓度为2.5%的戊二醛溶液中，4℃固定2h。用1%的四氧化锇固定后用乙醇梯度脱水，环氧树脂Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片机进行超薄切片，铅铀双重染色，H-600透射式电子显微镜下观察拍照。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件处理所得数据，所有数据以均数±标准差表示，采用重复测量设计的方差分析及单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 冠脉血管反应性的测定

2.1.1 冠脉对Ach的舒张反应：累加浓度法观察各组冠脉血管对Ach的浓度舒张曲线，同一浓度下与Ⅰ组相比，Ⅱ组的舒张率明显下降(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组无统计学差异(P>0.05)，见图1。

图1 各组大鼠冠脉血管对Ach的舒张作用量效曲线

2.1.2 冠脉对5-HT的收缩反应：同一浓度下与Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组收缩率明显升高(P<0.01)，Ⅳ组的变化无统计学差异(P<0.05);与Ⅱ、Ⅲ组相比，Ⅳ组收缩率明显下降(P<0.01)，见图2。

图2 各组大鼠冠脉血管对5-HT的收缩作用量效曲线

2.2 电镜下冠脉结构的变化 Ⅰ组：内皮细胞凸向管腔，内弹力膜厚薄不均，细胞核不规则，核内染色质轻度凝集，见图3。Ⅱ组：内皮细胞肿胀脱落，细胞膜不完整，内弹力膜部分断裂，细胞核呈圆形，核内染色质凝集，见图4。Ⅲ组：内皮细胞贴于内弹力膜，内弹力膜基本均匀，细胞核形状不规则，核内染色质轻度凝集，见图5。Ⅳ组：内皮细胞贴附于内弹力膜上，内弹力膜厚薄均匀，细胞核扁平，核内染色质分布基本均匀，见图6。

图3 电镜下Ⅰ组冠脉的结构(×5 000) 图4 电镜下Ⅱ组冠脉的结构(×5 000)

图5 电镜下Ⅲ组冠脉的结构(×5 000) 图6 电镜下Ⅳ组冠脉的结构(×5 000)

3 讨论

糖尿病血管并发症的发生发展与血管内皮细胞功能改变密切相关。内皮细胞作为血管的保护屏障，在高糖高脂环境下导致的氧化应激可损害内皮细胞的功能。内皮细胞合成分泌的多种活性物质参与了体内的病理生理过程[1]。正常情况下，血管内皮合成和释放一定量的NO和ET-1，调节血管张力和通透性及抗凝作用来维持营养物质和氧供应到相应组织。

生理情况下，Ach通过激动内皮细胞M3胆碱受体亚型，导致内皮源性NO释放而产生血管舒张。但在内皮细胞受损条件下，Ach的以上作用将不复存在。糖尿病内皮依赖性舒张功能异常，其机制还不清楚，它除了影响NO这条途径，还可能与血管平滑肌受损有关。可能机制为：(1)糖尿病时NO合成减少活性降低；(2)NO灭活增加[2]，主要影响因素如氧自由基及糖基化终末产物；(3)降低对NO的反应性，通过影响鸟苷酸环化酶途径；(4)对抗NO舒张效应的血管收缩剂如前列腺素类及内皮素的产生增加[3]。

病理情况下，内皮依赖性NO介导的舒张功能受损是糖尿病患者内皮功能障碍的指征[4]。如研究结果所示，糖尿病大鼠进行MIRI导致内皮细胞受损，以至于Ach内皮依赖性舒张功能明显下降，即便PCr预处理对于冠脉内皮依赖性舒张功能并无明显改善作用。而MIRI使冠脉对5-HT敏感性增高，最大收缩效能增强，PCr多次给药预处理能够降低冠脉对5-HT的高敏感性及收缩强度，在一定程度上可缓解冠脉血管的痉挛。总之，舒缩效应的总和是能增加冠脉血流量，增加心肌细胞灌注，从而起到心肌保护作用。前期研究也证实：磷酸肌酸能够增加糖尿病大鼠MIRI后血浆中NO的含量，减少ET-1的含量，调节血管舒缩因子的平衡[5]。

线粒体功能障碍是糖尿病导致的内皮细胞功能损伤的早期事件[6]。线粒体的主要功能是为细胞供能，还与细胞代谢、凋亡及信号传导通路相关[7]。糖尿病机体活性氧过度生成，可造成线粒体形态和功能的损害。如研究结果所示，缺血再灌注组内皮细胞明显肿胀脱落，细胞膜不完整，线粒体明显肿胀，部分呈空泡样改变。PCr预处理组内皮细胞均无明显水肿并贴附于内弹力膜，线粒体也无明显肿胀。外源性PCr补给，可提高心肌及冠脉高能磷酸化合物的含量，减轻能量代谢障碍，使细胞膜上泵的活性得以维持，减轻细胞水肿及线粒体肿胀甚至凋亡，对于维持线粒体形态和功能起到保护作用。

综上所述，PCr作为细胞重要的能量供应源，可为ATP补充能量，实验表明PCr是心肌细胞在缺血条件下首先衰竭的物质，且在组织缺氧诱导下心肌细胞会反应性地增加外源PCr摄取[8]。目前临床上已将它广泛应用于治疗心力衰竭、心肌梗死及体外循环手术，研究已证实，磷酸肌酸能够改善糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤后的心功能[9]，但对于冠脉保护的研究尚未报道。磷酸肌酸预处理，通过靶向改善线粒体功能，调节线粒体动力学平衡，抑制线粒体介导的凋亡是治疗血管病变的重要途径。对于线粒体功能的维护也就是对内皮细胞最大的保护，从而有益于冠脉血管舒缩功能的维持。