一例商品肉鸭脾脏坏死、病毒性肝炎与传染性浆膜炎三重感染的诊断

徐安衡 郑义 李超 郁春

肉鸭养殖生产是我国的特色畜牧产业，当前年出栏量已达到40亿只左右，在乡村振兴中发挥了重要作用。但近年来随着养殖规模的不断扩大，各类疫病的发生也日益严重，为肉鸭产业的发展带来了较大影响。其中，脾脏坏死、病毒性肝炎和传染性浆膜炎是肉鸭养殖中较为常见的疾病，一旦发病，常会给养殖场造成较大经济损失。如果发生混合感染，损失往往会更加严重。今年2月份，华东地区某商品肉鸭养殖场从7日龄左右即出现脾脏坏死病例，25日龄后病鸭又出现了肝脏出血、心包炎、气囊炎等症状，经实验室诊断确诊为呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和鸭疫里默氏杆菌三重混合感染，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 病料处理与细菌分离

发病鸭来自华东地区某肉鸭养殖场，该场前后送来两次病料，第一次在鸭群7日龄左右，死淘率上升至2%～3%，死亡鸭剖检可见明显脾脏出血，肝脏点状坏死;第二次在鸭群25日龄左右，死亡率每天达到1%～2%，剖检可见气囊炎、心包炎和肝周炎，脾脏呈大理石样，肾脏出血，肝脏肿胀、淤血。分别采集不同日龄病死鸭肝脏、脾脏、肾脏等作为病料，其中从肝脏划线接种血清平板，置于5% CO2培养箱37 ℃培养过夜，培养菌进行常见病原菌PCR鉴定;另外将采集的以上病料混合后以1：5比例加入生理盐水，匀浆形成组织混悬液，置-80 ℃冻融3次，4 ℃离心15 min，取上清进行病原PCR检测。

1.2 PCR检测

1.2.1 核酸提取 分离细菌及处理后的病料上清按照试剂盒（Axygen）说明书提取核酸，并保存于-20 ℃备用。

1.2.2 引物设计及PCR方法 利用本中心实验室设计的针对禽流感病毒（AIV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肝炎病毒1型和3型（DHV-1，DHV-3）、鸭呼肠孤病毒（DReoV）、鸭细小病毒（DPV）、鸭星状病毒（DastV）和鸭圆环病毒（DCV）等常见病毒的引物，以及鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌等常见细菌的引物，通过PCR或RT-PCR方法进行病毒核酸检测。

PCR反应体系25 μL：2 ×Taq PCR StarMix 12.5 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2 μL，超纯水9.5 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性2 min;94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，35个循环;72 ℃延伸5 min。

RT-PCR反应体系20 μL：2 × One Step Mix 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，超纯水5 μL，RNA模板3 μL。扩增条件：50 ℃ 反转录30 min，94 ℃ 预变性2 min;94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃延伸5 min。

PCR 产物用1.5%琼脂糖电泳进行检测后，凝胶成像系统观察并拍照记录结果。

2 结果

2.1 病理解剖与病变观察

7日龄病死雏鸭剖检可见脾脏出血（图1），有的肝脏表面分布有白色坏死点（图2）;25日龄病死鸭剖检可见明显气囊炎、心包炎和肝周炎，肝脏肿大、淤血（图3），脾脏呈大理石样病变（图4），部分病例表现脾脏坏死、萎缩（图5）。

2.2 细菌分离与染色镜检

细菌分离接种血清平板，经5% CO2 37 ℃过夜培养后，可见有整齐、凸起、细小的白色菌落生长。取典型菌落，涂布载玻片，经革兰氏染色在100X显微镜下观察，可见革兰氏阴性、无芽孢、短杆状形态细菌。

2.3 病原PCR检测

病原核酸PCR检测结果显示，7日龄病料中鸭新型呼肠孤病毒检测结果为阳性，扩增片段大小为230 bp;25日龄病料中鸭新型呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒3型和鸭疫里默氏杆菌检测结果均为阳性，扩增片段大小分别为230、250、670 bp;分离细菌PCR检测结果为鸭疫里默氏杆菌阳性，扩增片段大小为670 bp。结果见图6～8。

结合鸭群发病症状、剖检病变及实验室诊断结果，判断该病例在7日龄前感染鸭新型呼肠孤病毒，在25日龄前又混合感染鸭肝炎病毒3型和鸭疫里默氏杆菌导致发病。

3 讨论

近十年来随着我国肉鸭养殖的快速发展，肉鸭养殖的数量和密度不断增加，各类疫病的发生日益增多，发病情况也日趋复杂。由于新发病原的不断出现、变异加快以及养殖模式相对落后等原因，导致不同病原的混合感染比较常见，成为造成生产损失的重要原因[1-4]。杨晶等[3]针对肉鸭7种病毒性病原进行流行病学调查，发现二重混合感染比例为32.3%，甚至超过单一感染比例28.3%，而三重感染和四重感染的比例分别为22%和5.4%，说明混合感染已经成为鸭病发生的主流。

自2005年以來鸭新型呼肠孤病毒感染开始在我国福建、广东等地出现[5]，主要造成3～25日龄雏鸭发生肝脏、脾脏的出血和坏死。该病毒水平传播和垂直传播能力均较强，致死率一般不高，但感染后能够引起免疫抑制，非常容易引起其他病原的继发感染[4， 6-9]。呼肠孤病毒致病性并不强，不过一旦与其他病原形成混合感染，往往发病率和死亡率会大幅上升。鸭病毒性肝炎是肉鸭生产中最常见的疫病之一，目前病原包括鸭肝炎病毒1型和3型两种。该病对1周龄以内的雏鸭致病性最强，发病率和死亡率可达90%以上。由于肉鸭养殖中普遍在1日龄注射卵黄抗体用来预防本病，生产中已经很少见到低日龄肉鸭发病，反而在20～30日龄之间发病更加常见，但发病率和死亡率大幅下降，一般在10%～20%左右。浆膜炎则是商品鸭养殖中最常见的细菌类疾病，病原为鸭疫里默氏杆菌。根据国内外报道，该菌血清型至少有21种，国内当前流行的以1/2/6/7/10型为主，其中2/6/7型菌株致病性较强，鸭群感染后常造成重大损失。

鸭新型呼肠孤病毒由于损伤脾脏造成免疫抑制，感染后期常引起其他病原的继发感染，最常见的是大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌等细菌类病原。本病例中，在7日龄左右发病时仅检测到呼肠孤病毒，而25日龄后则同时检测到呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒3型和鸭疫里默氏杆菌，推测是早期感染呼肠孤病毒，之后由于管理不当又感染了鸭肝炎病毒和鸭疫里默氏杆菌，形成了三重感染导致损失严重。对于这种情况而言，前期感染呼肠孤病毒后的饲养管理较为关键，应密切关注鸭舍温度、通风和卫生状况，避免应激因素造成其他疫病继发。目前针对鸭病毒性肝炎已经有商品化的卵黄抗体可供使用，发病后及时注射能起到较好的治疗效果。传染性浆膜炎常发于3周龄以后，而且一旦感染高致病力菌株，鸭群的死亡数量会迅速上升。由于“限抗”的原因，这个阶段可供选用的药物非常有限，在浆膜炎多发的地区，建议在5～7日龄免疫多价鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗进行预防。

由于肉鸭养殖饲养周期较短，用于疫苗免疫和药物防控的时间较少，因此应该把重点放在饲养管理方面，从鸭苗质量、饲料品质以及环境控制等各个方面进行优化提高，尤其是将现有的传统简陋的饲养方式升级为规模化、智能化的生产模式，才能促进肉鸭产业的健康发展。

参考文献：

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[3] 杨晶，张日腾，王振忠，等.我国部分地区鸭病毒性疫病共感染的流行病学调查[J].中国兽医学报，2018， 38（10）：1872-1877.

[4] 张青林， 郭海祥，薛素强，等. 一例樱桃谷肉鸭H9亚型禽流感和呼肠孤病毒混合感染的病例报告[J].兽医导刊，2019（09）：71-72.

[5] 陈少莺，陈仕龙，林锋强，等.新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J].病毒学报，2012，28 （03）：224-230.

[6] 李美霞，杨军，艾博，等. 呼肠孤病毒与链球菌混合感染雏鸭的病理学研究[J].湖北农业科学，2014，53（08）：1848-1850.

[7] 刘伟，崔国杰，陈少莺.新型鸭呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒混合感染的診断及病原分离[J]. 畜牧与兽医，2014，46（05）：92-95.

[8] 刘伟，林贵富，谢海军，等.一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断[J]. 福建畜牧兽医，2014，36（04）：70-72.

[9] 赵赫，何莉，李美霞，等.鸭源呼肠孤病毒与沙门菌共感染雏鸭的免疫器官的动态病理学观察[J]. 中国兽医科学，2014， 44（06）：650-655.