甲状腺乳头状癌细胞中长链非编码RNA FoxP4-AS1的表达及其生物学功能

杨惠芳，汤蕊，罗雪，，高庆军，陈星宏，赵代伟，4

（1.贵州医科大学临床医学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州省毕节市第一人民医院甲状腺外科，贵州 毕节 551700；3.贵州医科大学附属医院甲状腺外科，贵州 贵阳 550000；4.贵州省第二人民医院甲状腺外科，贵州 贵阳 550004）

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌中最常见的病理组织学类型，约占甲状腺癌（thyroid carcinoma， TC） 的80% 以上[1]，近年来其发病率以每年4%的速度上升[2]。多数的PTC 患者通过手术治疗、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH） 抑制治疗及131I治疗后可达到临床治愈，但侵袭性较高的PTC 患者其5年复发率约5%[3]，且晚期PTC 通常预后不良[4]。PTC 的发生发展机制尚不清楚，但已发现不少危险因素与PTC 的发生发展有关，包括遗传、环境暴露、表观遗传改变等[5-6]。因此，深入探讨PTC 发生发展的分子机理对于寻求新的防治靶点有着重要意义。

长链非编码RNAs （long non-coding RNA，lncRNA）在调控肿瘤的发生发展中起着重要作用。其中，长链非编码RNA FoxP4-AS1（lncRNA FoxP4-AS1） 是位于6 号染色体的基因间lncRNA，与FoxP4 反向头尾分布，但外显子无互补区域，含588 个碱基对[7-8]。lncRNA FoxP4-AS1 首次在结直肠癌中被发现[9]，此后，人们在多种肿瘤中发现FoxP4-AS1 的表达，包括骨肉瘤[10]、胃癌[11]、前列腺癌[12]、宫颈癌[13]、鼻咽癌[14]、食管鳞状细胞癌[15]以及胰腺导管腺癌[16]等，且FoxP4-AS1 在肿瘤中高表达，预示着预后不良。而课题组前期研究[17]发现，FoxP4-AS1 在PTC 中表达下调，其低表达是PTC 区域淋巴结转移的独立危险因素。但FoxP4-AS1 对PTC 细胞生物学的影响及其作用机理目前尚不清楚。因此，本研究旨在通过慢病毒稳定转染技术探究lncRNA FoxP4-AS1 对PTC 细胞（TPC-1、K1 细胞） 生物学行为的影响，及其潜在的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1（武汉普诺赛生命科技有限公司），人甲状腺乳头状癌细胞K1 及人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1（上海市长海医院）； RPMI 1640 培养基和DMEM 培养基（Gibco，美国）；6 孔、24 孔组织培养板（康宁公司，美国）；过表达慢病毒（上海吉凯基因医学科技股份有限公司，GOSL0262738，中国）；TRIzol（Ambion，美国）；ECL 显色试剂盒、nanodrop 2000（Thermo Fisher， 美 国）； LnRcute LncRNA cDNA第一链合成试剂盒、LnRcute LncRNA 荧光定量检测试剂盒（天根生化科技有限公司，中国北京）；CFX Connect 检测系统（Bio-rad，美国）；CCK-8 试剂盒（APE×BIO 公司，美国）；甲醇、4%多聚甲醛、苏木素（Servicebio，中国武汉）；EdU 检测试剂盒（Ribobio，中国广州）；DAPI（Solarbio，中国北京）；周期试剂盒（凯基生物，中国）；流式细胞仪（Beckman，美国）；Transwell 小室、基质胶（Corning 公司，美国）；抗体（贵州华远生物技术有限公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组和转染 人PTC 细胞TPC-1 和人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1 培养在RPMI 1640 完全培养基（含10% 胎牛血清、0.1 mg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素）中，人甲状腺乳头状癌细胞K1 培养在DMEM 完全培养基（含10% 胎牛血清、0.1 mg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素）中，置于恒温培养箱中（37 ℃、5% CO2）。将甲状腺乳头状癌细胞（TPC-1、K1 细胞） 分别分为FoxP4-AS1组（转染FoxP4-AS1 过表达慢病毒载体）和阴性对照组（negative control，NC 组）（转染空载病毒）。慢病毒的构建由上海吉凯基因医学科技股份有限公司完成，其核苷酸序列为：FoxP4-AS1 组：GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC CCT GGT TTT CTG TGG AAA G； NC：CAC ACA TTC CAC AGG CTA GCT GCA CTT TGA TAA CAA TAA ACT C。取对数生长期细胞制备细胞悬液，以5×104个/孔的细胞密度接种于6 孔板中，待细胞贴壁，将配制好的病毒感染液（MOI=100，病毒滴度=1×108TU/mL）加入6 孔板中，置于细胞培养箱中培养12～16 h 后，更换为完全培养基，继续培养72 h，中途可换液。感染72 h 后（细胞汇合度达70%～80%），用嘌呤霉素（2 μg/mL）对细胞进行筛选，倒置荧光显微镜观察细胞感染效率。

1.2.2 RNA 提取及qRT-PCR TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA，Nanodrop 2000 测定RNA 的浓度和纯度。取1 μg 总RNA，用LnRcute LncRNA cDNA 第一链合成试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，LnRcute LncRNA 荧光定量检测试剂盒和CFX Connect 检测系统进行qRT-PCR 反应。lncRNAFoxP4-AS1 的表达以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。FoxP4-AS1 引物及内参引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成（表1）。 以上实验均重复3 次。

表1 FoxP4-AS1引物及内参引物序列Table 1 The primer sequences of FoxP4-AS1 and internal reference

1.2.3 细胞增殖实验（CCK-8 法） 细胞以5×103/孔的密度接种于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。转染0、1、2、3、4 d 后，将10 μL CCK-8 试剂加入每个孔中，在37 ℃下孵育1 h。使用酶标仪分别检测0、1、2、3、4 d 的450 nm 处的吸光度。以上实验均重复3 次。

1.2.4 细胞克隆形成实验 制备好细胞悬液后，以1 000 个/孔的细胞密度接种于六孔板中，每组设3 个平行复孔，置于37 ℃培养箱中培养。2 周左右肉眼可观察到细胞克隆团，弃去培养基，以PBS 洗3 次，甲醇固定细胞15 min，晾干后加入苏木素染色30 min，晾干后扫描拍照，计数肉眼可见的细胞克隆团。

1.2.5 EdU 实验 用EdU 检测试剂盒检测细胞的增殖能力。用慢病毒或空载体转染两种PTC 细胞系，以20 000 个细胞/孔的细胞密度接种于24 孔板中，每组设3 个平行复孔。将50 μM EdU 标记培养基加入到24 孔板中，置于培养于37 ℃、5% CO2的环境中孵育2 h。用4%多聚甲醛固定细胞30 min，甘氨酸（2 mg/mL） 洗涤残留的甲醛，用0.5% Triton X-100 脱色摇床孵育10 min。PBS 清洗后，加入抗EdU 工作溶液在室温避光染色30 min，然后用100 μL DAPI 在室温孵育5 min 并在荧光显微镜下进行观察。

1.2.6 细胞侵袭及迁移实验 用Transwell 小室检测细胞的侵袭及迁移能力。转染后的细胞消化，用无血清的RPMI 1640 或DMEM 培养基重悬，添加到涂有Matrigel 基质胶的Transwell 上室（迁移试验不添加基质胶）中，下室加入含10%血清的1640 或DMEM 培养基。小室置于细胞恒温培养箱中培养24 h 后，轻轻除去膜上的细胞，膜下的细胞用甲醇固定，结晶紫染色并计数。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期 制备好细胞悬液后，用PBS 缓冲液洗涤细胞1 次（离心800 r/min，5 min），收集细胞行70%乙醇4 ℃过夜，再离心收集细胞，PBS 重悬，加入提前配制好的500 μL 碘化丙啶（propidium，PI）/核糖核酸酶A（Rnase A）（Rnase A∶PI=1∶9） 染色工作液，室温避光染色30 min 后，经流式细胞仪分析细胞周期。以上实验均重复3 次。

1.2.8 Western blot 收集细胞后，经裂解液裂解，在4 ℃下离心12 000 r/min，30 min 提取蛋白。使用BCA 法测定蛋白浓度后，40 μg 蛋白经12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF 膜上，在室温条件下用5% 脱脂牛奶封闭2 h，再加入CDK4/cyclinD1 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。TBST 洗去一抗，HRP 标记 二抗（1∶5 000） 室 温孵育1 h，TBST 洗3 次，通过ECL 化学发光试剂盒显影，以GAPDH （1∶1 000） 作为内参。以上实验均重复3 次。

1.2.9 皮下移植瘤模型的构建 选取4～8 周龄雌性NOD-SCID 小鼠20 只，用耳标钳对小鼠标记，随机将小鼠分为4 组，每组5 只。消化细胞，用生理盐水重悬并调整细胞浓度为5×107个/mL，于小鼠背部皮下注射体积为0.2 mL 的单细胞悬液，接种后每5 天观察1 次，选取适当时间，将实验小鼠处死，取出肿瘤进行后续实验。本实验经贵州医科大学实验动物伦理委员会审批（伦理审批号：No1800829）。

1.2.10 FoxP4-AS1 在甲状腺癌中的功能富集分析下载KEGG 数据库中的GSEA 数据，对FoxP4-AS1 低表达和FoxP4-AS1 高表达的基因组之间的差异通路进行了富集分析。统计出满足标准（P<0.05）的相关信号通路，使用ggplot2 包可视化重要功能及通路。

1.3 统计学处理

分别采用SPSS 22.0 和Graphpad Prism 9.0 统计软件进行统计学分析和绘图，对符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTC细胞中lncRNA FoxP4-AS1表达水平

通过qRT-PCR 检测人PTC 细胞系（TPC-1、K1细胞）和人正常甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori3-1细胞） 中FoxP4-AS1 的表达情况。结果显示：人PTC 细胞系TPC-1、K1 中FoxP4-AS1 的表达水平明显低于人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1，差异均有统计学意义（0.660±0.078vs.1.000±0.000；0.523±0.006vs.1.000±0.000，均P<0.05）（图1）。

图1 qRT-PCR检测lncRNA FoxP4-AS1表达Figure 1 qRT-PCR detection of lncRNA FoxP4-AS1 expression

2.2 慢病毒稳定转染结果

为探讨FoxP4-AS1 在PTC 细胞中的生物学功能，通过慢病毒转染实验将FoxP4-AS1 过表达慢病毒转染到TPC-1、K1 细胞中，qRT-PCR 检验转染效能。结果显示，转染FoxP4-AS1 过表达慢病毒（FoxP4-AS1 组） 后，TPC-1、K1 细胞的FoxP4-AS1表达水平明显升高，与NC 组相比，差异有统计学意义（0.440±0.026vs.1.000±0.000；0.273±0.021vs.1.000±0.000，均P<0.01）（图2）。

图2 qRT-PCR检测转染效果Figure 2 qRT-PCR detection of transfection effect

2.3 FoxP4-AS1对PTC细胞增殖能力的影响

细胞增殖实验（CCK-8 法）、细胞克隆形成实验、EdU 实验结果均显示：慢病毒转染过表达FoxP4-AS1 后，TPC-1、K1 细胞的增殖能力明显降低，差异有统计学意义（均P<0.05）（图3）。

图3 细胞的增殖能力检测 A：CCK-8实验；B：细胞克隆形成实验；C：EdU实验Figure 3 Detection of cell proliferative capacity A:CCK-8 assay;B:Colony formation assay;C:EdU incorporation assay

2.4 FoxP4-AS1 对PTC 细胞侵袭和迁移能力的影响

Transwell 实验结果显示：使用慢病毒稳定转染技术过表达FoxP4-AS1 后，与NC 组相比，TPC-1、K1 细胞的侵袭和迁移能力明显降低，差异有统计学意义（均P<0.05）（图4）。

图4 Transwell实验检测PTC细胞的迁移和侵袭能力Figure 4 Transwell assay for detecting the migration and invasion abilities of PTC cells

2.5 流式细胞术检测细胞周期

细胞周期实验结果显示：通过转染使TPC-1、K1 细胞的FoxP4-AS1 表达上调，采用流式细胞术检测两种细胞周期情况。结果显示，过表达FoxP4-AS1 后，细胞周期阻滞在G0/G1期，差异有统计学意义（P<0.01）（图5）。

图5 流式细胞术检测PTC细胞的细胞周期Figure 5 Detection of cell cycle of PTC cells by flow cytometry

2.6 GEPIA数据库和LncTar网站的分析

GEPIA 数据库的预测信息显示，仅CDK4 在甲状腺癌和癌旁（thyroid carcinoma，THCA） 中有较为明显的差异，在CDK2 和CDK6 中无明显差异。LncTar（http://www.cuilab.cn/lnctar）网站通过FASTA格式预测FoxP4-AS1 与CDK4 的潜在相互作用靶点，结果显示，FoxP4-AS1 与CDK4 存在多个潜在的相互作用靶点，且结合较牢固（图6）。

图6 GEPIA数据库和LncTar网站分析FoxP4-AS1与CDK4潜在的相互作用靶点Figure 6 Analysis of the potential interaction targets of FoxP4-AS1 and CDK4 using the GEPIA database and LncTar website

2.7 Western blot检测转染后的PTC细胞中CDK4/cyclinD1表达情况

通过慢病毒过表达TPC-1、K1 细胞中的FoxP4-AS1 表达水平，采用Western blot 检测CDK4/cyclinD1表达情况。结果显示，过表达FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）（图7）。

2.8 皮下移植瘤模型的构建

NOD-SCID 小鼠饲养于SPF 级的环境中，待小鼠适应环境，5 d 后于皮下接种细胞，30 d 后处死小鼠，每5 天对小鼠及瘤体进行观察和测量。结果显示：过表达FoxP4-AS1 后，皮下移植瘤大小及体积明显缩小。HE 染色显示：肿瘤细胞胞质稀疏，胞核形态各异，肿瘤为PTC。免疫组织化学染色实验结果表明：过表达FoxP4-AS1 后，Ki-67表达明显减少（图8）。

图8 皮下移植瘤实验 A：瘤体大小及体积；B：HE染色（×100）；C：免疫组织化学染色法检测Ki-67的表达（×100）Figure 8 Subcutaneous tumor transplantation model A:Tumor size and volume; B: HE staining (×100); C:The expression of Ki-67 detected by immunohistochemical staining(×100)

2.9 TC中FoxP4-AS1的功能富集分析

基于KEGG 数据库，对FoxP4-AS1 低表达和FoxP4-AS1 高表达的基因组之间的差异通路进行了GSEA 富集分析，PI3K-Akt-mTOR 通路、细胞周期、细胞凋亡、免疫调节相互作用在FOXP4-AS1 低表达组中被富集（图9A-D）；DNA 甲基化、氧化应激通路等在FOXP4-AS1高表达组中被富集（图9E-F）。

图9 通路富集分析 A：PI3K-Akt-mTOR 通路；B：细胞周期；C：细胞凋亡；D：免疫调节相互作用；E：DNA 甲基化；F：氧化应激通路Figure 9 Pathway enrichment analysis A: PI3K-Akt-mTOR pathway; B: Cell cycle; C: Apoptosis; D: Immunomodulatory interactions;E:DNA methylation;F:oxidative stress pathway

3 讨 论

近年来随着B 超、细针穿刺活检技术的普及，PTC 的发病率逐年升高，且逐渐趋向年轻化[18]。尽管PTC 的治疗手段取得了长足的进步，但PTC 患者的复发率和癌症相关病死率并没有明显改善[19]。因此，寻找PTC 有效的分子生物标志物和治疗靶点是十分必要的。

lncRNA 是肿瘤发生发展的重要调控因子。它是一类长度超过200 个核苷酸，大小在200 bp 到100 kb 之间，且无编码蛋白质能力的转录物[20]。许多研究表明lncRNA 对肿瘤的发生发展中起着关键作用[21]，通过多种方式参与调控细胞生物学过程，促进或抑制肿瘤发生与进展[22]。研究[23]发现lncRNA 是多种生物调节活性的主要调控因子，如基因表达、剂量补偿、等位基因印迹和基因组包装等。随着人们对lncRNA 研究的深入，越来越多的证据表明lncRNA 表达失调对肿瘤的发生发展发挥至关重要的作用，它们的表达失调与恶性肿瘤的发生、侵袭和转移有关[24-26]，lncRNA FoxP4-AS1是其中研究相对较少的基因。已有研究[9-16]证明FoxP4-AS1 在许多恶性肿瘤中高表达，其高表达预示着预后不良。而在甲状腺乳头状癌中，已有文献[17]表明，FoxP4-AS1 在PTC 中表达明显降低，其低表达是PTC 区域淋巴结转移的独立危险因素，但其对PTC 细胞生物学行为的影响及其作用机理目前尚不明确。

因此，本实验在此基础上继续研究，首先通过qRT-PCR 检测lncRNA FoxP4-AS1 在PTC 细胞和人甲状腺正常滤泡上皮细胞中的表达水平，通过慢病毒稳定转染技术对PTC 细胞（TPC-1 细胞和K1 细胞）进行FoxP4-AS1 过表达，qRT-PCR 检测其转染效能；同时探究FoxP4-AS1 对PTC 细胞生物学行为的影响。此外，通过生信分析预测FoxP4-AS1 与CDK4 之间的潜在作用靶点，并通过Western blot 进行验证，同时进行动物实验验证。研究发现，FoxP4-AS1 在PTC 细胞中表达下调，这与汤蕊等[17]研究结果一致。过表达FoxP4-AS1 后，CCK-8 实验和细胞克隆形成实验均显示FoxP4-AS1 组的增殖能力降低，这提示FoxP4-AS1 可抑制PTC 的增殖。同时EdU 实验结果表明：在TPC-1 细胞和K1 细胞中，FoxP4-AS1 组的细胞数目（带红色荧光）较NC 组来说是减少的，说明上调FoxP4-AS1 表达可抑制两种细胞的增殖能力，进一步证明FoxP4-AS1 能够抑制PTC 细胞增殖。此外，上调FoxP4-AS1 后，Transwell实验结果显示：两种细胞的侵袭和迁移能力明显降低，提示FoxP4-AS1 可以降低PTC 的侵袭性，可以作为PTC 的一个保护性因素。增殖作为癌细胞的重要特性，由于肿瘤细胞周期失控，增殖无极限性，是导致恶性肿瘤复发的重要原因[27]。因此我们通过流式细胞术检测PTC 细胞的周期，结果表明：过表达FoxP4-AS1 后，细胞周期阻滞在G0/G1期。由于CDK 是调控细胞周期的一个关键物质，它是通过对其他蛋白质的化学修饰来驱动整个细胞周期的，而cyclin 具有调控CDK 的功能，且通常以cyclin/CDK 复合物的形式发挥作用，CDK 和cyclin 相互配合能更有效地控制整个细胞周期的全过程[28]。细胞周期的失调会导致一系列的疾病，如癌症、神经退行性疾病和中风等[29-30]。因此，本研究使用GEPIA 数据库预测CDK2/4/6 在THCA 中的表达，发现仅CDK4 在THCA 中的表达有差异，而CDK2 和CDK6 则没有明显差异，LncTar 网站分析显示FoxP4-AS1 与CDK4 之间存在潜在的相互作用靶点，且结合较牢固，提示FoxP4-AS1 可能直接与CDK4 相互结合而发挥作用。因在细胞周期的调控过程中，CDK4 通常与cyclinD1 结合发挥作用[31]，因此，通过Western blot 实验检验FoxP4-AS1 与CDK4 之间的相关性发现，上调FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 表达减少，提示FoxP4-AS1 可能负向调控CDK4/cyclinD1，进而抑制细胞增殖。通过建立NOD-SCID 小鼠异种移植瘤模型，发现过表达FoxP4-AS1 后，NOD-SCID 小鼠所成肿瘤的大小和体积均明显降低，且Ki-67 表达减少，提示FoxP4-AS1可能作为一个保护性因素在PTC 中发挥作用。甲状腺癌中FoxP4-AS1 的功能富集分析显示，PI3KAkt-mTOR 通路、细胞周期、细胞凋亡、免疫调节相互作用在FoxP4-AS1 低表达组中被富集，与细胞功能学实验结果相一致。提示FoxP4-AS1 通过细胞周期发挥作用。

综上所述，FoxP4-AS1 在PTC 中发挥抑癌基因作用，过表达FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 表达减少，抑癌作用增强，FoxP4-AS1 在PTC 中可能通过负向调控CDK4/cyclinD1 的表达发挥抑癌作用，且具有一定的抑制PTC 细胞增殖、侵袭和迁移的能力，有望成为PTC 治疗的潜在临床靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。