外源性IL-6 通过STAT3 通路促进卵巢癌细胞对顺铂耐药

沈洋洋，牛秀珑，郁春艳，郑小燕，刘俊汝，邓为民

（1.天津医科大学基础医学院免疫学系，国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室，天津 300070；2.中国人民武装警察部队特色医学中心勤务环境皮肤疾病防治研究所，天津 300162）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）是妇科恶性肿瘤中最常见的死因之一，是全球女性第七位常见癌症，同时死亡率也较高，5 年生存率低于50%[1-2]。化疗是肿瘤治疗的重要手段之一，然而耐药严重阻碍了肿瘤化疗效果。顺铂是目前用于治疗OvCa 最有效的化疗药物之一，但患者经常会出现对顺铂治疗的耐药，因此了解OvCa 对顺铂耐药机制对肿瘤治疗具有重要意义。近年来，越来越多的研究关注肿瘤与炎症之间的联系。白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）是由多种细胞产生的炎症因子，研究发现，IL-6 与OvCa 之间关系密切，涉及肿瘤的生存、生长、侵袭、血管生成和耐药[3-4]。临床研究显示，IL-6水平与肿瘤的不良预后和化疗敏感性相关，IL-6 和OvCa 的恶性程度以及预后相关[5-6]，IL-6 可以促进OvCa 干细胞聚集[7]，可通过核因子（NF）-κB 途径促进OvCa 耐药[8]等。本研究对外源性IL-6 在诱导OvCa 顺铂耐药中的作用进行了初步研究，为临床解决OvCa 顺铂耐药提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 裸鼠购自中国北京军事医学科学院实验动物中心；人OvCa 细胞系A2780 细胞购自美国ATCC 公司；胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO 公司；RPMI-1640 培养基购自中国南京凯基生物科技发展有限公司；重组人白细胞介素-6（recombinant human interleukin 6，rhIL-6）、AG490（JAK2/STAT3 抑制剂）购自美国Sigma 公司；STAT3 抗体购自美国SAB Biotech 公司；p-STAT3 抗体购自美国Cell Signaling 公司；β-actin 购自中国北京瑞康生物技术有限公司；顺铂购自中国齐鲁医药公司；HRP 酶标二抗购自美国Rockland 公司；Annexin V-FITC 凋亡试剂盒购自中国南京凯基生物科技发展有限公司；CCK8 试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A2780 细胞用含有10%FBS 的RPMI-1640 培养基培养，培养基中含80 U/mL 青霉素和80 μg/mL 链霉素，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，每1～2 d 更换培养基并消化传代。

1.2.2 CCK8 实验 取对数生长期A2780 细胞接种于96 孔板，每孔为3×103/100 μL，分为对照（Control）组、AG490 组、顺铂（Cisplatin）组、AG490+Cisplatin组、重组人白细胞介素-6（rhIL-6）组、rhIL-6+AG490 组、rhIL-6+Cisplatin 组和rhIL-6+AG490+Cisplatin 组，共8 组，每组设立3 个复孔。待细胞贴壁后，AG490 组、AG490+Cisplatin 组、rhIL-6+AG490组和rhIL-6+AG490+Cisplatin 组加入AG490（50 μmol）[9]预处理1 h，之后加入rhIL-6（50 ng/mL）[10]或顺铂（10 μmol），5%CO2、37°C 培养箱中培养72 h，培养结束后去除培养基，用Hank′s 洗涤两次，每孔加入100 μL 培养基（含10 μL 的CCK8 试剂），酶标仪检测波长为450 nm 的光密度值（OD450），利用SPSS 对数据进行统计学分析。

1.2.3 Western 印迹实验 取对数生长期A2780 细胞接种于6 孔板，每孔为5×105/2 mL，分为Control 组、AG490 组、rhIL-6 组和rhIL-6+AG490 组。细胞贴壁后加药处理12 h，将RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸蛋白酶抑制剂以100∶1∶1 配置裂解液，提取细胞总蛋白。BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，配置10%的分离胶，将40 μg/孔的蛋白用10%SDS-PAGE 进行电泳分离。电泳后将蛋白转印于PVDF 膜，100 V 转膜1 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭2 h 后，加入特异性一抗，4℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入HRP 标记的二抗室温孵育2 h。TBST清洗后化学发光底物检测试剂盒进行检测。将目的蛋白与内参的灰度比值作为蛋白的相对表达丰度。

1.2.4 细胞凋亡实验 取对数生长期A2780 细胞接种于12 孔板，每孔为1×105/mL，分为Control 组、AG490 组、Cisplatin 组、AG490+Cisplatin 组、rhIL-6组、rhIL-6+AG490 组、rhIL-6+Cisplatin 组和rhIL-6+AG490+Cisplatin 组，共8 组，同时设立空白管组和单染管组。细胞贴壁后AG490 组、AG490+Cisplatin 组、rhIL-6+AG490 组和rhIL-6+AG490+Cis platin 组加入AG490（50 μmol）预处理1 h 之后按实验方案各组加入rhIL-6（50 ng/mL）或顺铂（10 μmol），5%CO2、37℃培养箱中培养48 h。培养结束后用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，加入0.1%BSA-PBS 洗涤2 次。弃去上清，每管加入500 μL 试剂盒中的Binding Buffer 重悬细胞，混匀。加入5 μL的AnnexinV 溶液混匀，再加入5 μL 的碘化丙啶（PI）溶液，混匀。避光室温孵育10 min。细胞通过400 目筛网过滤成单细胞悬液备检。用流式细胞仪进行检测，用空白管和单染管调节电压和荧光补偿，Annexin V-FITC 绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测，PI 红色荧光通过PI 通道（FL2）检测，利用FlowJo 软件进行数据分析。

1.2.5 小鼠体内实验 将36 只8 周龄雌性裸鼠随机分为Control 组、rhIL-6 组、Cisplatin 组、AG490组、rhIL-6+Cisplatin 组和rhIL-6+AG490+Cisplatin组，共6 组，每组6 只。腹腔注射A2780 细胞（5×106/200 μL/鼠），按照不同分组腹腔注射rhIL-6、AG490和顺铂，其中第1 天开始注射rhIL-6[1 μg/（kg·周）]，第1 天开始注射AG490[5 mg/（kg·d）]，从第4 天开始注射顺铂 [4 mg/（kg·周）]，Control 组腹腔注射PBS。4 周后颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，观察瘤结节生成情况并拍照，计数瘤结节、称重。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析，其中符合正态分布数据以±s 表示。多组间相互比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组OvCa 细胞增殖情况 由图1 可知，与Control 组相比，rhIL-6 组细胞增殖增加[（1.330±0.024）vs.（1.264±0.012），t=4.148，P＜0.05]，Cisplatin组细胞增殖降低[（1.199±0.005）vs.（1.264±0.012），t=8.050，P＜0.01]，AG490 组细胞增殖无变化[（1.283±0.024）vs.（1.264±0.012），t=1.201，P＞0.05]。与Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin 组细胞增殖增加[（1.314±0.022）vs.（1.199±0.005），t=8.439，P ＜0.01]。与rhIL-6+Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 组细胞增殖降低[（1.242±0.011）vs.（1.314±0.022），t=4.860，P＜0.01]。

图1 各组细胞增殖的情况Fig 1 Result of cell proliferation in each group

2.2 各组p-STAT3 蛋白表达情况 由图2B 可见，与Control 组相比，rhIL-6 组p-STAT3 蛋白表达明显增加[（2.27±0.46）vs.（1.0±0），t=6.55，P＜0.01]。与rhIL-6 组相比，rhIL-6+AG490 组的p-STAT3 蛋白明显降低[（0.99±0.12）vs.（2.27±0.46），t=6.34，P＜0.01]。

2.3 各组细胞凋亡情况 由图3B 可知，与Control组相比，Cisplatin 组细胞凋亡显著增加 [（12.70±0.36）vs.（2.75±0.38），t=32.56，P＜0.001]。rhIL-6 组与Control 组 对 比 没 有 统 计 学 差 别[（3.49±0.40）vs.（2.75±0.38），t=2.272，P＞0.05]。与Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin 组细胞凋亡显著降低[（7.75±0.23）vs.（12.70±0.36），t=20.03，P＜0.001]。与rhIL-6+Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 组细胞凋亡显著增加[（13.36±0.37）vs.（7.75±0.23），t=22.16，P＜0.001]。与AG490+Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 组细胞凋亡差异无统计学意义[（12.88±0.87）vs.（13.36±0.37），t=0.8836，P>0.05]。2.4 各组瘤结节重量和大小情况 由图4B 可知，与Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin 组小鼠的瘤结节数量（图4A）和重量（图4B）明显增加[（0.206±0.072）vs.（0.107±0.022），t=2.783，P＜0.05]。与rhIL-6+Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 组瘤结节数量和重量均显著降低[（0.065±0.035）vs.（0.206±0.072），t=3.306，P＜0.05]。

3 讨论

OvCa 是困扰女性的三大生殖系统恶性肿瘤之一，且死亡率高居不下。顺铂是OvCa 主要的化疗药物，然而化疗耐药使肿瘤预后较差，耐药性是阻碍成功抗癌治疗的最棘手障碍之一，因此迫切需要解决耐药的问题。本实验通过体内体外两方面的实验，证实IL-6 可以通过STAT3 信号通路促进OvCa对顺铂耐药。

IL-6 是一种多功能促炎性因子，在与其膜结合受体（IL-6R）结合后激活经典的信号通路。IL-6 过表达和多种肿瘤相关，包括结直肠癌、OvCa、乳腺癌等[11]，与OvCa 的发生、发展、预后等密切相关。临床资料显示，OvCa 患者高表达IL-6，IL-6 水平升高与不良预后和化疗敏感性差相关，IL-6 可以诱导OvCa 细胞多药耐药基因的表达，内源性或外源性IL-6 诱导A2780 细胞中多药耐药蛋白表达升高，且与IL-6 呈正相关[12]，靶向IL-6 治疗已经被认为是一种可行的治疗手段。IL-6 调控下游多种信号通路，在肿瘤细胞对化疗耐药起着重要作用[11]，其中研究最多的是IL-6/JAK2/STAT3 轴[13]。

IL-6/JAK2/STAT3 轴在许多类型的癌症中均异常激活，而这种过度激活通常与不良的临床预后相关。在肿瘤微环境中，IL-6/JAK2/STAT3 信号转导可驱动肿瘤细胞的增殖、耐药、侵袭性和迁移，同时强烈抑制抗肿瘤免疫反应[14]。人OvCa 细胞系A2780不分泌IL-6 且对顺铂敏感[8]，因此本研究选择A2780 作为观察IL-6 影响OvCa 发生顺铂耐药机制的研究对象。CCK8 实验结果显示单独rhIL-6 可促进A2780 的增殖，顺铂联用rhIL-6 可以降低前者对A2780 增殖的抑制作用，而AG490 可以抑制rhIL-6 的作用，说明外源性IL-6 通过影响STAT3 通路促进A2780 增殖。细胞凋亡实验结果显示，与Cisplatin 组相比，联用rhIL-6 能促进A2780 对顺铂耐药，而这个作用被AG490 所抑制，同时与AG490+Cisplatin 组相比，增加rhIL-6 处理并无显著性差异，说明rhIL-6 通过STAT3 通路诱导OvCa 对顺铂耐药。此外Western 印迹结果表明，IL-6 可以显著促进p-STAT3 的表达，说明外源性IL-6 可以通过诱导STAT3 磷酸化来促进OvCa 抗凋亡和对顺铂耐药。和体外实验结果相同，小鼠体内实验结果显示，与Cisplatin 组相比，rhIL-6+Cisplatin 组小鼠瘤结节数量和重量明显增加，而再联用AG490会抑制rhIL-6 的作用，说明rhIL-6 通过STAT3 信号通路体内诱导OvCa 对顺铂耐药。IL-6/JAK2/STAT3 通路促进OvCa 对顺铂耐药的具体机制较为复杂，涉及多个方面，IL-6/JAK2/STAT3 轴在干细胞干性、诱导耐药蛋白、缺氧、上皮间质表型转化、促进抗凋亡蛋白表达和DNA 修复相关基因表达等多方面促进肿瘤耐药[15-20]。

综上所述，本研究从体内、体外两个方面证明外源性IL-6 可以通过STAT3 通路诱导OvCa 对顺铂耐药，为临床OvCa 患者治疗中炎症诱导耐药的处理提供新的思路和策略。