青藤碱通过PI3K/Akt信号通路改善大鼠踝关节炎的研究

何 龙,葛占洲,伍永权,郭马珑

1.濮阳市中医医院骨五科,濮阳 457000;2.河南省洛阳正骨医院骨科,郑州 450000

创伤性骨关节炎常发生于踝关节和膝关节,是残疾的重要原因之一[1]。目前由踝部骨折引起的创伤性关节炎是常见的踝关节骨关节炎,在临床上内踝骨折脱位尤为常见[2]。目前治疗踝关节骨关节炎的主要方案为保守治疗和手术治疗[3]。青藤碱是清风藤中主要的有效成分,具有镇痛、抗炎、调节免疫等药理作用。青藤碱在临床主要用于治疗类风湿关节炎和骨关节疾病等[4]。青藤碱可通过调节抗炎因子的表达、抑制炎症反应,从而改善踝关节部位的病变[5]。研究表明,青藤碱通过调节PI3K-Akt信号通路,发挥抗肿瘤作用[6]。课题组前期的研究发现,青藤碱可抑制骨关节炎,对关节软骨具有保护作用。本实验通过外力进行大鼠踝关节脱位骨折构建大鼠踝关节骨关节炎模型,以揭示青藤碱改善踝关节骨关节炎的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

164-5056型电泳仪(美国Bio-Rad公司);Multiskan Sky酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司);Light Ccler Ly C480型实时荧光定量PCR系统(瑞士罗氏公司);MoticBA 210型生物显微镜(北京汗盟紫星仪器仪表有限公司)。

1.2 试药

青藤碱(丽珠医药集团股份有限公司);细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司);质量浓度为4 g·mL-1的多聚甲醛(济南百博生物技术股份有限公司);戊巴比妥钠(上海信裕生物科技有限公司);番红O(北京博润莱特科技有限公司);兔抗大鼠CC类趋化因子配体2(CC-chemokine ligand 2,CCL2,货号ab100777),Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen,COL Ⅱ,货号ab188570),软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP,货号ab260037),磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K,货号ab154598),p-PI3K(货号ab278545),蛋白激酶B(protein kinase B,Akt,货号ab126433),p-Akt(货号ab38449)和GAPDH(货号ab8245)一抗和山羊抗兔IgG(货号ab150077),均购自美国Abcam公司;超敏发光液(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 动物

SPF级雄性SD大鼠50只,12周龄,体质量(230±10) g,许可证号SCXK(京)2016-0011,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 分组和建模

随机将50只SD大鼠分为5组:空白组、模型组、青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组,每组10只。SD大鼠于动物房适应性饲养1周后,5组均用质量浓度为3 mg·mL-1的戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉。用体积分数75%的乙醇溶液消毒双侧踝关节后,于内踝处自下而上切开皮肤,分离皮下筋膜,用1 mL注射器制做的拉钩将肌腱向后侧牵拉。将小骨凿与角度固定器组合后置于胫骨远端,用中等力度将骨凿敲入内踝,明显感觉到落空感后,即内踝骨折。用3-0线缝合伤口后,将足部内翻造成脱位后,立即复位[7]。根据成人用药剂量(青藤碱2 mL)用Meeh-Rubner公式计算人鼠等效剂量,设立青藤碱高(12.5 mg·kg-1)、中(8 mg·kg-1)、低剂量组(2 mg·kg-1)[8]。大鼠手术1 d后,空白组和模型组于踝关节注射0.1 mL生理盐水,青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱高剂量组每天于踝关节分别注射青藤碱2、8、12.5 mg·kg-1,处理6周。

2.2 番红O染色与评分

所有大鼠安乐死后,分别将每组大鼠 (n=5)的右侧踝关节分离取出,于福尔马林中固定48 h后,置于乙二胺四乙酸中脱钙6周,再将每个踝关节正中冠状切成2个部分,进行常规脱水、浸蜡、包埋及切片后,进行番红O染色。在光学显微镜下观察各组大鼠踝关节的病理学变化。

2.3 ELISA检测

分别向每组大鼠 (n=5)的右踝关节囊注入100 μL生理盐水,将踝关节做5次屈伸运动后,用1 mL注射器吸出关节液,置于-80 ℃保存。检测前,取出关节液以1 000 r·min-1离心30 min后,取上清液。上清液和PBS按照1∶1混合后,根据ELISA试剂盒说明书操作,将对照品梯度稀释后,每组设置5个复孔,依次加入100 μL样品,孔板覆膜后于37 ℃孵育1 h后,弃去上清液,依次加入抗体工作液和酶结合液,覆膜后于37 ℃孵育30 min。加入显色液,避光孵育10 min,加入终止液,放入酶标仪检测各孔在波长450 nm处的A值。

2.4 real-time PCR检测

用Trizol法分别提取各组大鼠左踝关节软骨组织的总RNA。反转录合成cDNA(反转录条件:37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min)。随后在ABI 7500实时PCR系统上,对包含cDNA、引物和SYBR-Green qPCR Master Mix的qRT-PCR混合物进行real-time PCR。扩增条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,共计40个循环。以GAPDH为内参,以2-ct法进行统计。real-time PCR引物序列见表1。

表1 real-time PCR引物序列

2.5 Western blot检测

用RIPA对各组大鼠左踝关节的软骨组织进行裂解,提取总蛋白。用BCA法检测蛋白质浓度后,于100 ℃条件下变性。SDS-PAGE电泳分离总蛋白后,转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)。用质量浓度50 g·L-1的脱脂牛奶封闭2 h,用Tris缓冲液和聚山梨醇酯20的混合物洗涤3次,每次10 min后,将其放入对应的一抗(CCL2、COL Ⅱ、COMP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH)和一抗稀释混悬液(1∶1 000)中,4 ℃孵育过夜。再用Tris缓冲液和聚山梨醇酯20的混合物洗涤3次,放入二抗和二抗稀释液(1∶4 000)混悬液中,室温孵育2 h。用Tris缓冲液和聚山梨醇酯20的混合物洗涤3次,将发光液滴在膜上,显影、定影。用Image J软件对数据进行分析,以GAPDH为内参对蛋白表达量进行标准化。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 青藤碱对踝关节骨关节炎大鼠踝关节病理形态的影响

各组大鼠踝关节的病理形态见图1。由图1可见,模型组、青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组大鼠的胫骨远端及距骨软骨表面均有不同程度的退化,如软骨细胞的丢失、软骨表面纤维化。与模型组比较,青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组软骨表面的病理改变均有一定程度的改善。

注:A.空白组;B.模型组;C.青藤碱高剂量组;D.青藤碱中剂量组;E.青藤碱低剂量组;AC.关节软骨;SB.松质骨;箭头表示关节软骨的厚度。

3.2 大鼠踝关节液中炎症因子的表达水平

各组大鼠踝关节组织中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比较见表2。由表2可见,与空白组比较,模型组IL-1β、MMP-13和TNF-α的表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组IL-1β、MMP-13和TNF-α的表达水平显著上升(P<0.05);与青藤碱中剂量组比较,青藤碱高剂量组IL-1β、MMP-13和TNF-α的表达水平显著降低(P<0.05),而青藤碱低剂量组的变化差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠踝关节组织中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比较

3.3 大鼠踝关节软骨生物标志物mRNA和蛋白的表达水平

real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组比较,模型组CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表达量显著上升(P<0.05);与模型组比较,青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表达量显著降低(P<0.05);与青藤碱中剂量组比较,青藤碱高剂量组CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05),而青藤碱低剂量组CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表达量明显上升(P<0.05)。结果见图2、表3、表4。

表3 5组大鼠踝关节软骨组织中CCL2、COL Ⅱ和COMP蛋白表达水平的比较

表4 5组大鼠踝关节软骨组织中CCL2、COL Ⅱ和COMP mRNA表达量的比较

注:A.空白组;B.模型组;C.青藤碱高剂量组;D.青藤碱中剂量组;E.青藤碱低剂量组。

3.4 大鼠PI3K-Akt信号通路的变化

Western blot结果显示,与空白组比较,模型组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值显著升高(P<0.05);与模型组比较,青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组和青藤碱低剂量组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值显著降低(P<0.05);与青藤碱中剂量组比较,青藤碱高剂量组和青藤碱低剂量组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图3和表5。

表5 5组大鼠踝关节组织中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的比较

注:A.空白组;B.模型组;C.青藤碱高剂量组;D.青藤碱中剂量组;E.青藤碱低剂量组。

4 讨论

骨关节炎是一种软骨的慢性退行性疾病,常发生于膝关节和踝关节,同时出现关节软骨下骨硬化、骨质增生等问题[9-10]。踝关节骨性关节炎的临床发病率较高,且多为继发性,具有长期重复性,主要症状为踝关节的疼痛和僵硬、关节肿胀和积液[11-12]。

目前构建踝关节骨性关节炎模型主要是通过切断踝关节部分韧带,而内踝骨折及内踝骨折伴脱位是导致踝关节骨性关节炎的主要原因[13],课题组前期建立了骨折伴脱位大鼠模型,结果显示,模型组大鼠的踝关节出现软骨细胞丢失和基质丢失,表面粗糙并且出现纤维样改变,踝关节液中炎症因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表达水平上升,并且CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表达量也明显升高,这与临床报道的结果一致,故认为踝关节骨性关节炎模型构建成功。

青藤碱是青风藤的主要成分,具有抗炎、抑制免疫等作用,其最主要的优势是不良反应较少、安全系数高、不产生药物依赖性[14]。研究表明,青藤碱可以抑制关节液中MMP-13和COMP的表达,从而缓解软骨退变的进程[15]。青藤碱可抑制膝关节炎的软骨中自噬,抑制PI3K-Akt等炎症信号通路,从而发挥抗炎作用[16]。研究表明,青藤碱具有强大的抗炎作用,并且毒性小,具有较大的开发潜力。青藤碱抑制膝骨关节炎的作用已在实验研究中得到证实[17],炎性反应是骨关节炎病理生理变化的重要特征,炎性因子的表达量增加是加速骨关节炎软骨退化的重要因素。本研究的结果显示,高、中、低剂量的青藤碱均可以改善踝关节的病理形态,使软骨细胞丢失量减少,并使纤维样减轻。与模型组比较,青藤碱高、中、低剂量组大鼠踝关节液中炎症因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表达水平降低,同时软骨中CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表达量降低,与文献报道的青藤碱的效果一致。文献报道,PI3K-Akt信号通路与骨关节炎密切相关,认为其是抗炎和抗软骨细胞凋亡的重要通路[18-19]。PI3K-Akt信号通路被激活后,加重骨关节炎的软骨退化[20]。青藤碱高、中剂量可显著抑制PI3K-Akt信号通路,从而下调CCL2、COL Ⅱ、COMP的表达水平。

综上所述,青藤碱可抑制PI3K/Akt信号通路的转导,抑制炎性因子IL-1β、MMP-13、TNF-α、CCL2、COLⅡ、COMP的表达,从而改善踝关节的软骨退化,为临床治疗踝关节骨关节炎提供参考。