朱砂七碱制前后的化学成分分析

程茜菲,张玩涛,韩小娟,宋小妹

1.陕西国际商贸学院,西安 712046;2.陕西中医药大学,西安 712046

朱砂七为蓼科植物毛脉蓼[Polygonumcillinerve(Nakai) Ohwi]的块根,在我国主要分布于陕西、湖北、四川、贵州和东北等地,在陕西主要分布于秦岭佛坪和太白山[1],为“太白七药”之一,且已被《陕西卫生志》列为陕西地道名贵草药[2]。活性成分研究结果显示,大黄素为朱砂七的主要活性成分之一,具有抑菌、抗病毒、抗炎和抗溃疡的活性[3-5]。

《陕西中草药》记载,朱砂七应用于临床时,抗菌消炎、顺气活血、凉血止血、镇痛解痉、止痛止泻、促进溃疡愈合应用生品;补肾应用盐制者;止血应用醋制者;健胃应用碱制者。不同炮制品临床应用不同,民间治疗胃部疾病,如胃炎、消化不良等时常采用碱制者。中药经炮制后,可能会发生化学成分种类或量的变化,从而使其药理作用发生变化[6-11]。本研究以指纹图谱(药材全貌)结合特征性成分含量测定,对炮制前、后朱砂七化学成分的变化进行分析,为明确朱砂七碱制品临床治疗疾病的药效物质基础奠定基础,为朱砂七临床合理应用提供理论指导,并为针对朱砂七其他碱制品的研究提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪、Empower色谱工作站、TE124S型电子分析天平均购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;Milli-Q Reference超纯水仪[默克化工技术(上海)有限公司];超声清洗器(上海易净超声波仪器有限公司)。

1.2 试药

实验用朱砂七,生品9批次,购于药材销售商;碱制品9批次,自制,均经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为朱砂七的块根。样品信息见表1。

表1 样品信息

大黄素(编号110756-201913)、大黄素甲醚(编号110758-201817)均购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司);磷酸(分析纯,天津市天力化学试剂有限公司);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测波长:254 nm;柱温:35 ℃;流动相:甲醇-10 mL·L-1磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序见表2;进样量:10 μL。结果见图1。

注:A.对照品溶液;B.供试品;1～11.共有峰;10.大黄素;11.大黄素甲醚。

表2 洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 精密称取大黄素和大黄素甲醚对照品适量,加甲醇制成每毫升含大黄素0.18 mg、大黄素甲醚0.246 mg的混合对照品溶液。

2.2.2大黄素对照品溶液的配制 精密称取大黄素对照品适量,加甲醇分别制成质量浓度分别为0.017 8、0.089 0、0.178 0、0.267 0、0.445 0、0.890 0 mg·mL-1的大黄素对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定药材1 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入乙醇50 mL,称定质量,超声30 min,冷却至室温,称定质量,用上述溶剂补足缺失的质量,混匀,经0.45 μm滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系考察 将2.2.2项下不同质量浓度大黄素对照品溶液按照2.1项下色谱条件进样检测,以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归,得线性回归方程y=3.7x+1.9×105,r=0.999 8。

2.4.2精密度实验 将2.2.1项下混合对照品溶液按照2.1项下色谱条件连续测定6次。计算得大黄素和大黄素甲醚对照品峰面积的RSD值均小于2.5%,说明该方法的精密度良好。

2.4.3重复性实验 取药材(P9)6份,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定。计算得6份样品11个共有峰峰面积的RSD值均小于3.5%,说明该方法的重复性良好。

2.4.4稳定性实验 取药材(P9)1份,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件,分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定。计算得11个共有峰峰面积的RSD值均小于3.5%,说明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.5回收率实验 取药材(P9)共9份,于每份样品中加入大黄素对照品适量,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定。结果显示,回收率在95%～105%范围内,RSD值为1.19%,说明该方法的准确度良好。结果见表3。

表3 回收率实验结果

2.5 样品含量测定

将18批样品(生品和碱制品),按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样测定,记录色谱图,并根据大黄素线性回归方程计算样品中大黄素的含量。结果见表4。

表4 样品中大黄素的含量

3 分析

3.1 指纹图谱

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”(2012版)对朱砂七生品和碱制品图谱进行分析,朱砂七生品及对照指纹图谱见图2,由相似度计算结果可知,生品与其对照指纹图谱R相似度值均>0.98。朱砂七碱制品及对照指纹图谱见图3,由相似度计算结果可知,碱制品色谱图与其对照指纹图谱R相似度值均>0.93。朱砂七生品、碱制品色谱图与生成的对照谱图R见图4,由相似度计算结果可知,三者相似度值均>0.897,经比较,朱砂七生品与碱制品色谱图相似度降低,说明朱砂七通过碱制后化学成分有一定变化。

图2 9批次朱砂七生品及对照指纹图谱

图3 9批次朱砂七碱制品及对照指纹图谱

图4 朱砂七生品、碱制品及对照指纹图谱

3.2 特征性成分(大黄素)含量分析

用SPSS 17.0软件,以大黄素含量为评价指标,对朱砂七生品和碱制品进行分析。用平方Euclidean distance方法[12-13]进行聚类分析。结果见图5。

根据图5可知,当阈值大于20时,S1、S2、S3、S5、S6、S9、P3、P5、P7、P8 10批药材聚为第一类,其中包含生品6批、碱制品4批;S4、S7、S8、P1、P2、P4、P6、P9 8批聚为第二类,其中包含生品3批、碱制品5批。根据分类结果可知,第一类中生品批次相对较多,第二类中碱制品批次较多,说明大黄素含量在朱砂七不同碱制品中存在一定的差异。通过药材来源信息可知,碱制品均为实验室自制。通过对比可知,除生品S5经炮制后大黄素含量无明显增加外,其他批次的生品经炮制后大黄素的含量均有不同程度的增加,增加最大幅度为13.7 mg·g-1,最小幅度为1.2 mg·g-1。结果见表5。

图5 聚类分析结果

表5 朱砂七碱制前后大黄素含量的变化

4 讨论

中药化学成分是其治疗疾病的物质基础,不同炮制品临床应用不同,与其化学成分的差异有一定相关性。本研究通过指纹图谱和单个成分(大黄素)定性、定量分析发现,朱砂七碱制前、后整体化学成分发生变化,且碱制后大黄素的含量增加。

根据古书记载和民间应用,用朱砂七碱制品治疗胃部疾病。目前在针对朱砂七药理作用的研究中,实验药物多用朱砂七总大黄素提取物[14-15],药理研究表明朱砂七总大黄素具有抗炎作用。大黄素为朱砂七总大黄素重要组成成分之一,已有多篇文献报道,大黄素具有抑菌[16-17]、抗病毒[18]、抗炎[19]和抗溃疡活性[20]。

因此,本研究可初步阐明大黄素为朱砂七碱制品治疗疾病的物质基础,为朱砂七碱制品化学成分的研究提供思路,也可为朱砂七质量控制、质量管理提供科学依据。