雪白睡莲花活性成分对奶牛乳腺炎主要致病菌抑菌和抗炎作用研究

张 伟，朱怡萱，彭 菲，刘诗芃，向微微，赛福丁·阿不拉，阿得力江·吾斯曼，刘丹丹*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.满洲里海关技术中心，内蒙古满洲里 021400 )

奶牛乳腺炎是由于病原微生物黏附于乳腺组织而引发的一种泌乳期奶牛常见病，严重影响奶牛养殖产业的发展。研究发现，引发奶牛乳腺炎的病原微生物高达130多种，其中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及链球菌占80%以上[1]。目前，临床治疗奶牛乳腺炎以抗菌药物为主，但随着抗菌药物的长期使用甚至滥用，细菌产生耐药性、乳中药物残留等问题日渐凸显。因此，寻找新型、安全、低残留的抑菌抗炎兽用药物意义重大。已有研究证实，天然药材及其多种次生产物对致乳腺炎病原菌具有良好的抑制作用[2-3]，应用植物中获取的抑菌抗炎成分，来预防和控制奶牛乳腺炎的发生，具有低毒、环保、高效等优点，因此该防治方式已逐渐被现代畜牧业所关注。

雪白睡莲花是睡莲科睡莲属雪白睡莲(Nymphaeacandida)的干燥花蕾，主要分布于我国新疆南部地区[4]。《中华本草维吾尔药卷》中记载，雪白睡莲花具有清热解毒、镇静安神、益心护脑等功效，临床上常用于治疗咽痛、慢惊风、热症所致的头疼、咳嗽等病症，有一定的抗氧化、保肝、抗菌、降血糖和神经保护等作用[5]。多项研究报道[6-8]，不同提取方法提取出的睡莲活性成分对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌效果。本实验室前期研究已证实雪白睡莲花水提物和醇提物均对奶牛乳房炎致病菌和其所引发的炎症有一定抑菌抗炎作用，基于此，为评价其多糖、黄酮的抑菌抗炎效果，本研究拟定采用牛津杯法结合倍比稀释法测定抑菌圈、最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)，探讨雪白睡莲花多糖、黄酮对奶牛乳腺炎主要致病菌(大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌)的抑制效果；同时，建立小鼠耳廓肿胀模型，考察雪白睡莲花多糖、黄酮的抗炎作用，以期为雪白睡莲花的开发利用及作为防治奶牛乳腺炎潜力药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 雪白睡莲花，购自新疆维吾尔自治区民族医院； SPF级雄性昆明小鼠(18 g～22 g)，由新疆医科大学试验动物中心提供；奶牛乳腺炎主要致病菌大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)E3、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)9-14、链球菌(Streptococcusagalactiae)151105，由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。

1.1.2 主要试剂 地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司产品；胰酪胨大豆肉汤培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基，青岛日水生物技术有限公司产品；MH(A)培养基，北京索莱宝科技有限公司产品；二甲苯等其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 小型粉碎机(ZN-08)，北京兴时利和科技发展有限公司产品；电子天平(ME-204E)，梅特勒- 托利多仪器(上海)有限公司产品；三用恒温水箱(12H-W420)，江苏省金坛市医疗仪器厂产品；低速离心机(TDL-40B)，上海安亭科学仪器厂产品；磁力搅拌器(MS-H280-pro)，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司产品；旋转蒸发仪(RE-52)，上海亚荣生化仪器厂产品；空气震荡培养箱(ST-F160AC)，北京桑翌实验仪器研究所产品；酶标分析仪(HTX)，美国伯腾仪器有限公司产品；超声波清洗器(WD-9415E)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 将于500 mL/L甘油-20 ℃保存的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别接种于液体肉汤培养基中，37 ℃恒温培养24 h后，划线接种于琼脂固体培养基上，37 ℃恒温培养至相应细菌生长期，挑取典型单菌落接种于肉汤培养基中，摇床37 ℃恒温培养24 h，4 ℃保存备用。

1.2.2 睡莲花活性成分提取与鉴定

1.2.2.1 雪白睡莲花多糖的提取与鉴定 雪白睡莲花多糖的提取：成品干燥雪白睡莲花打粉，40目过筛后称取50 g，加蒸馏水700 mL，210 W超声功率提取30 min，重复提取2次，合并2次滤液，减压浓缩，加无水乙醇至其浓度为800 mg/mL，4 ℃静置醇析，离心取沉淀物，烘干得到雪白睡莲花多糖。

雪白睡莲花多糖的鉴定：采用Molish法[9]，以乳糖溶液为阳性对照，蒸馏水为空白对照，量取1 mL待测溶液加入0.5 mL 50 mg/mL苯酚，混匀后缓慢加入2.5 mL浓硫酸，液面间有绀青色环判定为多糖阳性。

1.2.2.2 雪白睡莲花黄酮的提取与鉴定 雪白睡莲花黄酮的提取：成品干燥雪白睡莲花打粉，40目过筛后称取50 g，加入800 mL/L 乙醇1 500 mL，180 W超声功率提取20 min，抽滤除杂，减压浓缩，烘干得黄酮。

雪白睡莲花黄酮的鉴定：采用盐酸-镁粉反应法[10]，以芦丁溶液作阳性对照，蒸馏水作空白对照，量取1 mL黄酮溶液，加入镁粉，再缓慢滴加浓盐酸，片刻后观察，液体变为橙红色至紫色判断为黄酮阳性。

1.2.3 雪白睡莲花多糖提取率测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 首先精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，从中吸取10 mL再次定容至100 mL，得0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至试管，加蒸馏水补足2 mL，然后分别加入1 mL苯酚溶液，5 mL浓硫酸震荡摇匀，冷却后置于30 ℃水浴锅中，水浴20 min后用紫外分光光度计于波长490 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.3.2 雪白睡莲花多糖得率的测定 精密称取50 mg所得的多糖，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，从中吸取10 mL定容至100 mL，作为待测样品液。精密量取待测样品液1 mL至试管，加蒸馏水补足2 mL后，按照1.2.3.1方法测定其吸光度值，依回归方程计算多糖提取率。

1.2.4 雪白睡莲花黄酮提取率的测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 称取10 mg芦丁标准品于25 mL容量瓶中，用800 mL/L乙醇定容。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL至试管中，加入50 mg/mL亚硝酸钠0.3 mL，混匀静置6 min后，加入100 mg/mL硝酸铝0.3 mL，混匀静置6 min后，再加入40 mg/mL氢氧化钠溶液4 mL，加水定容至10 mL静置15 min，用紫外分光光度计于波长510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.2.4.2 雪白睡莲花黄酮提取率的测定 称取10 mg所得的雪白睡莲花黄酮置于25 mL容量瓶中，用800 mL/L乙醇定容，作为待测样品液。量取待测样品液1 mL至试管中，按照1.2.4.1方法测定其吸光度值，依回归方程计算黄酮提取率。

1.2.5 雪白睡莲花活性成分体外抑菌试验

1.2.5.1 雪白睡莲花活性成分抑菌效果测定 采用牛津杯法[2]，将高压灭菌后的琼脂培养基每个培养皿中分装20 mL，使其均匀摊布，放置在超净台内等待凝固，取4 ℃保存菌液以麦氏比浊管为参考，稀释至菌液含菌量为1.5×106CFU/mL。每个培养皿中加入100 μL稀释好的菌液，用涂布棒涂布均匀，将4个牛津杯等距放置于铺满菌液的的培养基上，每杯中分别加入100 μL多糖、黄酮、生理盐水、庆大霉素，每种菌株及其试验药物重复3次，以生理盐水作为空白对照组，庆大霉素作为阳性对照组。37 ℃恒温培养18 h～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌效果判定标准：R≥15 mm为高敏，10 mm≤R<15 mm为中敏，8 mm≤R<10 mm为低敏，R<8 mm为不敏感，-表示无抑菌圈。

1.2.5.2 最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)的测定 采用倍比稀释法对药物进行MIC的测定[11]。在无菌96孔板各孔内加入灭菌肉汤100 μL，第1孔中加入灭菌受试药液100 μL(药液质量浓度为0.1 g/mL)，吹打混匀，从中吸取混匀液加入下一孔，如此二倍稀释至第9孔后弃去100 μL。第10孔不加药，第11孔中只加受试药物，第12孔二者均不加，作为空白对照组。前10孔中分别加入10 μL菌液混匀，置于37 ℃恒温培养箱中恒温培养，观察结果。

选用MIC试验中未见浑浊的孔，每孔各取50 μL液体，加入琼脂肉汤固体培养基，用灭菌涂布棒均匀涂布于培养基中，每孔做3个平行重复，37 ℃恒温培养18 h～24 h。以平板上生长的菌落数小于5个作为受试药物的MBC[12]。

1.2.6 雪白睡莲花活性成分体外抗炎试验 取雄性昆明小鼠16只，体质量18 g～22 g，随机分为4组：雪白睡莲花多糖、黄酮组，按1.37 g/kg灌胃；阳性对照组选取地塞米松，按0.02 g/kg灌胃；空白对照组选取生理盐水，按10 mL/kg灌胃。每天灌胃1次，连续灌胃7 d，第7天给药后0.5 h，将0.02 mL二甲苯均匀涂抹于小鼠左耳致炎，右耳不做处理，1 h后处死小鼠剪下双耳，用8 mm打孔器取耳片，电子天平称重。观察雪白睡莲花活性成分对二甲苯引起的耳廓肿胀度、肿胀率及肿胀抑制率的影响。计算方法如下[11]：

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量

肿胀率=[(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量]×100%

肿胀抑制率=[(空白对照组耳肿胀度-用药组耳肿胀度)/空白对照组耳肿胀度]×100%

2 结果

2.1 雪白睡莲花多糖的理化鉴别及提取率测定结果

经Molish反应鉴定，提取物中含有多糖。以吸光度A为纵坐标，葡萄糖标准品溶液浓度(mg/mL)为横坐标，绘制成标准曲线(图1)。经计算得到的回归方程为：y= 8.271 4x+ 0.059 4，相关系数r2=0.997 6，根据此回归方程计算出本样品多糖提取率为51.78%。

图1 多糖标准曲线

2.2 雪白睡莲花黄酮的理化鉴别及提取率结果

经盐酸-镁粉反应鉴定，提取物中含有黄酮。以吸光度A为纵坐标，标准品溶液浓度(mg/mL)为横坐标，绘制成标准曲线(图2)。经计算得到的回归方程为：y= 11.47 5x+ 0.020 6，相关系数r=0.998 8，根据此回归方程计算出本样品黄酮提取率为12.00%。

图2 黄酮标准曲线

2.3 雪白睡莲花活性成分体外抑菌试验结果

2.3.1 抑菌圈的测定结果 由表1可知，金黄色葡萄球菌对雪白睡莲花多糖高敏，抑菌圈直径为23.01 mm±0.43 mm；金黄色葡萄球菌、链球菌对雪白睡莲花黄酮高敏，抑菌圈直径分别为24.07 mm±0.72 mm、16.80 mm±0.37 mm，大肠埃希氏菌对雪白睡莲花黄酮中敏，抑菌圈直径为13.30 mm±0.27 mm。

表1 雪白睡莲花多糖、黄酮的体外抑菌结果

2.3.2 MIC和MBC的测定结果 雪白睡莲花多糖、黄酮对3种致病菌的MIC和MBC测定结果见表2。雪白睡莲花多糖对金黄色葡萄球菌的MIC为3.125 mg/mL，MBC为6.25 mg/mL，表明雪白睡莲花多糖对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用；雪白睡莲花黄酮对3种致病菌(大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌)的MIC分别为6.25、3.125、0.39 mg/mL，MBC分别为12.5、6.25、0.78 mg/mL，提示雪白睡莲花黄酮对3种致病菌均有抑制作用。

表2 雪白睡莲花多糖、黄酮的MIC和MBC结果

2.4 雪白睡莲花活性成分体外抗炎试验结果

由表3可知，与空白对照组相比，雪白睡莲花多糖组、黄酮组能明显降低二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，且差异极显著(P<0.01)，肿胀抑制率分别为83.11%、65.15%；与阳性对照组对比，雪白睡莲花多糖组肿胀抑制率变化差异不显著；表明雪白睡莲花多糖、黄酮对急性炎症肿胀有一定的抑制作用。

表3 雪白睡莲花活性成分耳廓肿胀试验结果

3 讨论

研究表明，多糖、黄酮是天然药物的重要活性成分，其结构复杂、药用价值高，不同植物的多糖、黄酮都普遍具有明显的抑菌、抗炎、降血脂、抗氧化、抗病毒、调节肠道微生态平衡及提高免疫功能等作用[12-17]，而黄酮、多糖及多酚类化合物是雪白睡莲花的主要活性成分。基于此，本研究对雪白睡莲花采用超声波提取法提取活性成分(多糖、黄酮)、对其活性成分进行理化鉴别及提取率测定。超声波提取法是利用超声波的空化效应，破坏植物细胞壁和细胞结构，加快细胞内活性成分的释放和溶解，从而提高提取率，因其操作简便、提取率高、产品纯度高、绿色环保等优点，被广泛用于中药活性成分的提取[20-22]。结果显示采用超声波提取法可成功提取目标物质，多糖、黄酮提取率分别为51.78%、12.00%。同时，本研究采用牛津杯法、倍比稀释法结合二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验，考察雪白睡莲花多糖、黄酮对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及链球菌的体外抑菌与抗炎效果。结果表明，金黄色葡萄球菌对雪白睡莲花多糖高度敏感，抑菌圈直径达23.01 mm±0.43 mm；金黄色葡萄球菌和链球菌对雪白睡莲花黄酮高度敏感，抑菌圈直径分别为24.07 mm±0.72 mm、16.80 mm±0.37 mm，大肠埃希氏菌对雪白睡莲黄酮中度敏感，抑菌圈直径为13.30 mm±0.27 mm。雪白睡莲花多糖、黄酮对3种致病菌均具有一定的抑菌作用，对供试菌的抑菌效果为金黄色葡萄球菌>链球菌>大肠埃希氏菌。抗炎试验结果显示，雪白睡莲花多糖、黄酮对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制效果，且多糖效果优于黄酮效果，表明二者对急性炎症有一定的抑制作用。

综上所述，雪白睡莲花黄酮、多糖成分对奶牛乳腺炎主要致病菌具有一定的的抑菌效果，能发挥抗炎作用，临床上对于雪白睡莲花黄酮和多酚的研究较多，研究方向偏向于肝纤维化保护作用[23-27]，多糖成分往往被忽略。本研究结果显示，超声波作用下，多糖成分提取率可观，且对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果极佳，抑制小鼠耳肿胀的效果极佳，表明雪白睡莲多糖在其活性成分中，占据一定的重要地位。后续将进一步对其多糖成分的作用机理展开研究，以期为雪白睡莲花的进一步开发利用奠定基础。