基于网络药理学探讨红核妇洁洗液抗感染的作用机制*

饶鸿宇，李沛波，谌攀，史志恒，苏薇薇

广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心/广东省热带亚热带植物资源重点实验室/中山大学生命科学学院，广东 广州 510275

阴道感染，常表现为分泌物异常、瘙痒和异味等，是临床最常见的妇科疾病之一，降低了女性的生活质量。目前，临床治疗仍以抗生素为主，然而抗生素的长期应用增强了细菌的耐药性，容易诱导耐药菌的出现，另外抗菌药物的大量使用还会破坏阴道菌群稳态，导致疾病反复。传统中药经过长期的临床实践遴选，具有不良反应小、耐药率低等优势，具有良好的开发前景，但由于其作用机制尚不明确，限制了其应用。

红核妇洁洗液收录于《新药转正标准中药第33 册》，是用山楂核制得的外用洗剂，多项研究发现其对白色念珠菌等生殖道致病菌均有良好的杀灭功效，可用于各种原因引起的女性阴道感染，还能用于预防产后感染和会阴伤口的消毒等［1-5］。本团队研究了红核妇洁洗液的化学成分，发现了包括2，6-二甲氧基苯酚在内的多个具有良好抑菌活性的酚类化合物，但其他抗感染机制仍有待研究［6-8］。

中药网络药理学整合了包括医学、化学和生物学在内的多方面数据，运用计算机技术建立预测模型，可以从分子、细胞、组织等多个层面预测药物的作用机制，更好地揭示中药的整体作用，为多组分中药的机制研究提供了新的方向［9-12］。本研究基于网络药理学方法，首次探讨了红核妇洁洗液预防和治疗感染性疾病的作用机理，为红核妇洁洗液的临床应用提供了支撑。

1 方 法

1.1 化学成分的收集

基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，本团队对红核妇洁洗液的物质组成进行了系统的研究，共确证和指认了包括酚类和醛酮类等在内的92 个化合物，其中多个酚类化合物展现出了良好的抗菌活性，揭示了红核妇洁洗液的化学成分［6-7］。

1.2 交集靶点的确定及药材-活性成分-交集靶点网络的构建

在DisGeNET（http：//www. disgenet. org/）中对“infection”进行搜库，得到与感染性疾病相关的靶基因名，同时将红核妇洁洗液所有化合物的结构导入TCMSP（http：//tcmspw. com/）、SwissTarget-Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和CTD（https：//ctdbase. org/），明确红核妇洁洗液的全部潜在靶标基因［8］。搜集两者的交集数据，并制作维恩图，明确红核妇洁洗液发挥抗感染功效的潜在靶基因。再运用Cytoscape3.7.2对上述相关的靶点和对应化合物进行网络可视化处理，同时研究该网络的特征。

1.3 交集靶点通路分析和功能分析

为进一步挖掘靶基因的功能，将“交集数据”导入DAVID v6.7（https：//david. ncifcrf. gov/），选定研究目标为人种（homo sapiens），分析其通路信息（KEGG，kyoto encyclopedia of genes and genomes）和生物学功能（GO，gene ontology），阐明红核妇洁洗液的作用机制［8］。

2 结 果

2.1 成分收集和靶点筛选

从DisGeNET 共获得491个抗感染相关的靶点，与搜集到的1 056 个红核妇洁洗液潜在作用靶点整合后，得到红核妇洁洗液抗感染的相关靶点143个（图1），用于后续网络构建。

图1 红核妇洁洗液成分潜在靶点与感染性疾病靶点Venn图Fig.1 Venn diagram of HHFJL potential targets and infection disease targets

2.2 网络分析

将药材-成分-靶点构建的网络图导入Cytoscape 进行拓扑分析，发现该网络共有227 个节点（包括84 个成分和143 个交集靶点），1 170 条边（图2）。在这些靶点中，Degree 排名靠前的靶点依次为PARP1、PTGS1、ESR1、IDO1、NOS2、ALOX5、EGFR、PTGS2、HDAC6、JAK1、PTPRC、PIK3CA、TLR9、MIF 和PTPN22，为红核妇洁洗液潜在的作用靶点。Degree 排名靠前的成分依次是Eugenol（丁香酚）、2-methoxy-4-（1-propenyl）-Phenol（异丁香酚）、2-methoxy-Phenol（愈创木酚）、Catechol（邻苯二酚）和3-methyl-1，2-Benzenediol（3-甲氧基邻苯二酚），是红核妇洁洗液发挥功效的潜在化合物。

图2 药材-成分-交集靶点网络图Fig.2 The herb-component-key target network

2.3 交集靶点通路分析和功能分析

由图3 可见，KEGG 分析（P< 0.05）共筛选出包括TNF 信号通路、TLR 信号通路、NF-kappa B 信号通路和NOD-like 受体信号通路等信号通路合计107条（P值越小，富集程度越高）。GO功能分析则关联到715 个条目（P<0.05），其中与脂多糖介导的信号通路、凋亡过程负调控、炎症反应、缺氧反应等生物过程相关的条目有570个，与酶结合、蛋白质结合、转录因子结合等分子功能相关条目有93 个，与细胞质基质、细胞外空间、细胞表面等细胞组成相关条目有52个（图4）。

图3 红核妇洁洗液交集靶点KEGG通路富集分析结果Fig.3 Pathway enrichment analysis of the key targets

图4 红核妇洁洗液交集靶点GO富集分析结果Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets

3 讨 论

纵观人类疾病发展史，感染性疾病是造成人类流行病的主要原因之一。随着青霉素的问世，抗菌药在一线抗感染过程中一直扮演着十分重要的角色。然而抗菌药的大量使用加剧了细菌的耐药趋势，部分菌株的耐药率已超过60%，甚至出现了对多种抗生素都具有耐药性的“超级细菌”，给公共医疗系统造成了巨大的负担［13］。传统中药经过长期的临床实践遴选，具有扎实的临床应用基础，但其体外抑菌能力距离现代医学界定的抗感染药物标准尚存在着差距。由此可见，传统的最小抑菌浓度评价体系在评估中药抗感染功效时存在局限性，必须运用更加合理评判体系去分析中药的抗感染功效。

多项临床研究发现红核妇洁洗液可用于治疗需氧菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、非特异性阴道炎和阴道瘙痒等多种妇科感染性疾病［2-3］。体外研究数据则表明红核妇洁洗液原液能抑制红色毛癣菌、犬小孢子菌和念珠菌等多种皮肤浅表真菌的生长，同时红核妇洁洗液中的2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基邻苯三酚等物质还可以有效杀灭阴道加德纳氏菌、白色念珠菌和大肠杆菌等生殖道致病菌［4-6］。由此可见，红核妇洁洗液可抑制多种微生物的生长，有利于感染性疾病的治疗和伤口的消毒等。

本研究采用网络药理学解析了红核洗液抗感染的有效成分，发现在92 个化合物中，包括愈创木酚、2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基邻苯三酚等64个化合物均与10 个以上靶点相关，其中排名最高的是丁香酚，为55 个。丁香酚可作用于细胞质膜表面，影响细胞膜的通透性和流通性，导致致病菌与宿主细胞的黏附减少，降低病原菌的致病性，还能影响细胞内容物的转运，促进钾离子和ATP的流失；此外，丁香酚还能激活细胞内的活性氧，诱导氧化应激，促使细菌和真菌的细胞凋亡［14-15］。Patrícia 等［16］对酚类化合物的抗菌活性进行了系统研究，发现愈创木酚对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金葡菌等均展现出良好的抑制功效。Yang 等［17］发现2，6-二甲氧基苯酚具有良好的抗菌和抗氧化活性，可应用于灭菌制剂的开发。杨梅等［18］运用DPPH 实验研究艾叶燃烧物的抗氧化活性，结果发现其中的5-叔丁基邻苯三酚可以清除自由基，具有良好的抗氧化能力。由此可见，红核洗液中的丁香酚、愈创木酚和2，6-二甲氧基苯酚等在对抗病原菌入侵、抑制病原菌生长和清除体内自由基等方面发挥了良好的功效，可以减轻机体的感染症状。

在“成分-靶点”研究中，本研究发现了红核妇洁洗液的潜在作用靶点中有43 个靶基因与10 个以上化合物相关，占30.07%，评分高低依次为PARP1、PTGS1、ESR1 和IDO1 等。PRAP1 是一种与DNA 损伤和细胞凋亡密切相关的DNA 修复酶，诸多研究表明PARP1 在病毒与宿主细胞结合过程中发挥着重要的作用［19-20］。Wang 等［21］发现PARP1 还可以抑制IRF1 的转录，影响Jurkat 细胞对感染的免疫应答。PTGS 是催化前列腺素合成的关键酶之一，大量研究表明PTGS1（又名COX1）在机体炎症反应和免疫调节过程中扮演着十分重要的角色［22-24］。ESR1 可介导雌激素反应，有研究发现ESR1 的激活与ZIKV 病毒的复制和登革热病毒诱导的细胞自噬具有一定的相关性［25-26］。此外，Laura 等［27］发现ESR1 还可以促进中性粒细胞迁移至阴道腔，对抗白色念珠菌等致病菌的入侵，降低阴道感染的风险。Noa 等［28］对沙眼衣原体感染进行研究，发现IDO1 可调节机体免疫反应，且该调节作用不受干扰素分泌的影响。因此，红核妇洁洗液可从抑制细菌、病毒感染和调节机体免疫功能等途径改善机体状态，发挥抗感染作用。

在对红核妇洁洗液作用的靶基因分析过程中，本研究发现包括脂多糖信号通路、NF-kappa B 信号通路、炎症反应和缺氧反应等多个信号通路和生物过程可能与红核妇洁洗液的抗感染治疗密不可分。做为革兰氏阴性菌细胞壁重要的组成成分，脂多糖可通过激活TLR4 诱导免疫反应，促进下游的NF-κB 和IRF3 等多条信号通路的活化，加重机体的氧化应激和炎症反应［29］。TNF 家族是与炎症刺激紧密相连的细胞因子，被激活的TNFR可以促进IL-1、IL-6 和IL-10 等细胞因子的释放，还能激活与细胞凋亡相关的MAPK-JNK 和NF-κB 等多条信号通路，激活磷脂酶A2 和5-脂氧合酶等多个蛋白，加重机体的炎症反应［30］。有研究表明药物和细胞可通过影响LPS 和TNF 信号通路等，降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 等细胞因子的含量，减轻炎症反应，促进机体的恢复［31-33］。与此同时，Yu等［34］发现能量代谢异常可影响巨噬细胞分化，加重机体感染症状。此外，Arnab 等［35］指出白色念珠菌等病原菌可通过调节局部免疫，适应缺氧环境，完成定植，增加感染复发的风险。因此，红核妇洁洗液可通过减轻炎症反应和氧化应激，改善细胞缺氧等方面，促进感染患者的痊愈。

综上所述，红核妇洁洗液可通过多靶点多通路抑制病原菌的入侵和繁殖，还能调节免疫应答、减轻炎症反应、缓解氧化应激损伤等，促进感染症状的消退和患者的痊愈。本研究剖析了红核妇洁洗液的作用靶点和信号通路，为红核妇洁洗液在治疗感染性疾病方面的应用提供了合理的解释。