仙芪扶正颗粒定性定量方法研究

刘学杰，张俊生,杜丽君，马静华

(1.烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台 264000；2.烟台市中医医院，山东 烟台 264000)

仙芪扶正颗粒是由仙鹤草、黄芪、陈皮、党参、茯苓、酒黄精、枸杞子、酒女贞子、盐菟丝子、当归、鸡血藤、地榆、大枣、甘草14味中药经过水煎提取而制成的医疗机构复方制剂，经大量临床实践证明该制剂对于肿瘤放化疗后血细胞减少症及食少纳呆、体倦乏力等脾肾虚弱、气血亏虚之症具有很好的治疗效果。本方临床使用已有十余年，具有坚实的临床基础。仙芪扶正颗粒目前并无明确的质量标准，为了更好地对仙芪扶正颗粒的质量加以控制，本文作者在查阅相关文献[1-4]基础上开展研究，方中君药仙鹤草并无明显的指标性成分可供做含量测定，黄芪虽有指标性成分黄芪甲苷，但本文作者尝试后发现，黄芪甲苷回收率不符合要求，因此本文选择对陈皮中橙皮苷进行含量测定。此外，本文除了对黄芪、枸杞子、陈皮、地榆进行薄层鉴别外，还参照《中国药典》2020年版(一部)对茯苓、黄精、酒女贞子、盐菟丝子、当归、鸡血藤等进行定性研究，结果发现以上各位药材薄层色谱干扰严重，其样品的分离度未能达到制定标准的要求，故在初步制定标准的过程中未纳入正文。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国安捷伦1200高效液相色谱仪；日本岛津 Auw120D电子天平；KQ-300DE超声波仪器。青岛基亿达硅胶G板；水为Milipore制水机制备。

1.2 试药 黄芪甲苷(批号：110781-201717)、黄芪(批号：120974-201612)、枸杞子(批号：121072-201611)、橙皮苷(批号:110721-201818)、地榆(批号：121286-201703)均购自中国食品药品检定研究院；仙芪扶正颗粒样品及阴性供试品为制剂室自制(批号分别为20190501、20190502、20190503)；乙腈为进口色谱纯(Fisher)；试验中所用其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 黄芪 取本品适量，研细，称取10 g置圆底烧瓶，水浴回流1 h，取滤液蒸干，残渣分次加水20 mL使溶解并转移至分液漏斗中，以水饱和的正丁醇30 mL萃取2次，正丁醇液以2% NaOH溶液洗涤2次，每次40 mL，弃去洗液，加正丁醇饱和的水液50 mL洗涤，取正丁醇液置水浴使蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取黄芪对照药材1 g(购自中国食品药品检定研究院)同法制成对照药材溶液。另取黄芪甲苷对照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液[5]。取上述制备液于同一色谱板展开，结果见图1。

1.缺黄芪空白；2.黄芪甲苷；3.黄芪；4、5、6.三批供试品

2.2 枸杞子 取本品10 g，研细，加水50 mL使溶解，超声30 min，滤过，取滤液用乙酸乙酯30 mL萃取2次，合并萃取液置水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。

另取枸杞子对照药材1 g(购自中国食品药品检定研究院)同法制成枸杞子对照药材溶液[6]。取上述制备液于同一色谱板展开，结果见图2。

1.缺枸杞子空白；2.枸杞子；3、4、5.三批供试品

2.3 陈皮 取本品18 g，研细，加乙醇50 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL，微热使溶解，乙醚提取2次，每次20 mL,弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇液40 mL分两次提取，再以正丁醇饱和的水50 mL分次洗涤，取正丁醇液，蒸干，加甲醇2 mL溶解残渣，作为供试品溶液。另取橙皮苷0.5 mg加甲醇1 mL使溶解，作为对照品溶液。取上述制备液于同一色谱板展开，结果见图3。

1.缺陈皮空白；2.橙皮苷；3.陈皮；4、5、6.三批供试品

2.4 地榆 另取地榆对照药材0.5 g,加甲醇20 mL回流提取30 min，放置室温，取滤液蒸干，残渣分次加水20 mL使溶解，并转移至分液漏斗，用水饱和的正丁醇40 mL分两次萃取，合并萃取液，分别用2% NaOH溶液和正丁醇饱和的水洗涤2次，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为地榆对照药材溶液。取“2.1”项下制备液于同一色谱板展开，结果见图4。

1.缺地榆空白；2.地榆对照药材；3、4、5.三批供试品

3 橙皮苷含量测定

3.1 溶液的制备

3.1.1 样品处理及供试品溶液的制备 取装量差异下的本品内容物，研细，精密称定3 g置平底烧瓶，精密加入甲醇50 mL，秤定，水浴回流1 h，放冷，用甲醇补足减少重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3.1.2 对照品溶液的制备 取橙皮苷对照品11.45 mg加甲醇制成每1 mL含橙皮苷45.8 μg的溶液，作为对照品溶液。

3.1.3 缺陈皮空白溶液的制备 取陈皮阴性供试品按照“3.1.1”项下制备方法，制成陈皮阴性供试品溶液。

3.2 色谱条件 色谱柱：C18柱；流动相：乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)；检测波长：283 nm，柱温箱温度30 ℃[5,7]。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000。

3.3 系统适用性试验

3.3.1 专属性试验 分别取上述“3.1.1”“3.1.2”“3.1.3”项下制备溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果表明，供试品色谱中，在与橙皮苷对照品色谱相应位置上，有相同的吸收峰，而陈皮阴性供试品溶液色谱无明显干扰，见图5～7。

图5 橙皮苷对照品

图6 供试品

图7 缺陈皮供试品

3.3.2 线性关系考察 取橙皮苷对照品溶液分别进样0.114 5、0.229、0.458、0.572 5、1.374、2.29 μg，按照“3.2”项下色谱条件进行测定。以峰面积积分值的对数为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，结果进样量在0.114 5～2.29 μg范围内线性关系良好。对所得数据进行回归分析，得回归方程：Y=25.627X+1.775 6，r=0.999 7，结果见表1，线性关系见图8。

表1 线性关系考察结果

图8 橙皮苷的标准曲线

3.3.3 精密度试验 取同份仙芪扶正颗粒，按照“3.1”项下方法制备成供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL。结果6次测定峰面积的RSD为0.60%，表明精密度良好(见表2)。

表2 精密度试验结果

3.3.4 稳定性试验 取同份仙芪扶正颗粒，按照“3.1”项下制备成供试品溶液，每隔约2 h进样测定1次，每次进样10 μL，共测定6次。结果显示，6次测定橙皮苷测定峰面积RSD为1.46%，表明在10 h内橙皮苷的稳定性良好(见表3)。

表3 稳定性试验结果

3.3.5 重复性试验 取同一批仙芪扶正颗粒(批号：20190501)样品6份，按含量测定项下，依法测定含量，6次测定结果范围在0.611～0.624 mg·g-1，RSD为0.97%，说明重现性良好，结果见表4。

表4 重现性试验结果

3.3.6 加样回收率试验 取同一批仙芪扶正颗粒(批号：20190501)样品6份，每份约1.5 g，精密称定，分别以低、中、高3个水平精密加入橙皮苷对照品0.757、0.947、1.136 mg，按照“3.1.1”项下制备成供试品溶液，并按照“3.2”项下方法进行测定并计算回收率，结果见表5。

表5 回收率试验结果

3.3.7 样品的测定 取不同批次的仙芪扶正颗粒6份，按照“3.1.1”项下制备成供试品溶液，按照“3.2”项下方法进行测定并计算6批仙芪扶正颗粒样品中橙皮苷的含量，结果见表6。

表6 6批仙芪扶正颗粒中橙皮苷的含量测定结果

从以上6批中试生产的仙芪扶正颗粒中橙皮苷的含量可知，每克样品中橙皮苷的含量范围为0.61～0.63 mg·g-1，考虑到陈皮药材的质量差异，按照《中国药典》2020年版(一部)规定橙皮苷的含量不得低于3.5%，故规定橙皮苷的含量每袋不得少于3.60 mg(8 g/袋)。

4 讨论

4.1 含量测定中橙皮苷提取方法及时间的选择 橙皮苷的提取试验考察了超声和回流两种不同的方法，结果发现回流虽比超声操作烦琐，但是更能够使橙皮苷提取完全。试验中用加热回流方法提取橙皮苷分别考察了40、60和80 min的提取时间，结果表明60 min基本可以使橙皮苷提取完全，因此本文确定加热回流60 min作为橙皮苷的提取方法。

4.2 检测波长及流动相的选择 本文取橙皮苷对照品溶液进行扫描(200～400 nm)发现橙皮苷在283.0 nm处有最大吸收，结合相关参考文献，故确定本文含量测定的波长为283 nm。试验中对作者尝试用甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)[8]以及甲醇-0.11%磷酸溶液(39∶61)[9]作为流动相结果发现乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)能够使样品中橙皮苷分离效果较好且配置简单，故本文采用乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)作为流动相。