鱼腥草总黄酮对小鼠结肠炎防治作用的研究

杨乐天，杨晨，颜晓飞，石畅，左庚鑫，陈芳

(聊城大学药学院，山东 聊城 252059)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，是一种常见的炎症性肠道疾病，具有慢性、反复性、非特异性等特点[1-2]。该病的发病部位主要集中在大肠、结肠黏膜及黏膜下层[3]。UC的发病机制目前尚未明确，通常认为该病的病因与遗传、环境、免疫系统和肠道菌群等因素有关[4]。患者的临床症状主要表现为严重腹泻、腹痛、便血和肠道菌群失衡[5]等。近年来，UC在亚洲的发病率呈增长趋势[6]。目前用于治疗UC的西药[7]存在治疗效果不稳定及其副产物对肝肾有毒性等问题[8]。因此，研究筛选治疗效果稳定且毒副作用小的药物成为临床治疗UC的当务之急。

鱼腥草(HC)是一种具有特殊气味的多年生、三白草科草本植物，在日本、韩国、中国都有分布[9]。HC具有较高的食用和药用价值，它在传统保健[10]和治疗中发挥着重要的作用。目前大量的科学数据也证实了HC提取物拥有潜在的价值[11-14]。鱼腥草总黄酮为鱼腥草活性成分之一，具有抑菌、抗过敏和延缓衰老等作用[15]。本研究选取鱼腥草总黄酮作为本实验的研究对象，建立小鼠结肠炎模型，通过分析鱼腥草总黄酮对结肠炎小鼠体重变化、炎症因子等指标的影响，探索鱼腥草总黄酮对小鼠UC的治疗作用，克服目前临床主流药物效果不稳定及毒副作用等问题，为今后UC的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性ICR小鼠，SPF级，体重16～20 g。购自济南朋悅实验动物繁育有限公司[生产许可证号：SCXK9(鲁)20190003]。单笼饲养(29 cm×18 cm×16 cm),光照12L∶12D，温度(23±1)℃，适应环境7 d，自由取食(北京科澳协力饲料有限公司生产的小鼠饲料)和饮水。

1.2 主要试剂与仪器设备 鱼腥草提取物(10∶1，西安瑞林生物科技有限公司)；纤维素酶(10 000 U·L-1，南宁东恒华道生物科技有限公司)；葡聚糖硫酸钠盐(MW36000-50000，上海翊圣生物科技有限公司)；免疫试剂盒(TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ，武汉云克隆科技有限公司)；免疫试剂盒(Cr、BUN、ALT和AST，南京建成生物工程研究所)；磷酸缓冲盐溶液(PBS)、多聚甲醛(北京Solarbio公司)。

电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司(GB/T26497)]；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；立式压力蒸汽灭菌器[济南德强仪器有限公司(MJ376CD)]；优普系列超纯水仪[成都超纯科技有限公司(UPR-I-10T)]；漩涡振荡器[大龙生物科技有限公司(MX-E)]；海信冰箱[海信(北京)电器(BCD-230F/WS)]。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼腥草总黄酮的制备及检测 称取鱼腥草提取物5 g，加入纤维素酶至终浓度300 U·mL-1，参考梁燕妮等[16]的提取鱼腥草总黄酮工艺条件,本实验选用的提取条件为料液比1∶30，超声波辅助提取18 min，超声功率为300 W，乙醇浓度为55%，温度为室温。过滤后取上清液用石油醚1∶1萃取，40 ℃旋转蒸发至干燥，用60%乙醇溶出，采用冷冻干燥的方法得到总黄酮冻干粉。以含量较高的芦丁为标准品对照，采用高效液相色谱法测定鱼腥草总黄酮溶液的含量。

1.3.2 小鼠DSS模型建立及药物治疗 将小鼠随机分为6个组：空白对照组、DSS模型组、柳氮磺胺吡啶组、鱼腥草总黄酮中剂量组、鱼腥草总黄酮高剂量组、芦丁组，每组10只小鼠。小鼠适应环境7 d，正常组小鼠自由饮用二次水，给予足量的鼠粮；其他组小鼠参考药量为0.1～0.3 mL/10 g[17]，每天定时用3.5% DSS溶液自由饮水处理，连续饮用9 d，接着与正常组小鼠一样，连续3 d自由饮用二次水，整个建模周期为12 d。每天记录小鼠体重、粪便黏稠度和粪便隐血情况。诱导期结束后，除空白对照组和DSS模型组外，其他4个组用对应药物对小鼠进行灌胃处理，药物处理时间为6 d。

1.3.3 疾病活动指数 小鼠DAI指数，又称为疾病活动指数，即DAI Score=体重下降评分+粪便黏稠度评分+粪便隐血评分[18]。体重下降评分标准：0～5% 1分，5%～10% 2分，10%～15% 3分，>15% 4分。粪便黏稠度评分标准：正常0分，稀便2分，腹泻3分。粪便隐血评分标准：正常0分，阳性2分，血便3分。每天按照小鼠编号记录小鼠体重、粪便黏稠度和粪便隐血情况。

1.3.4 肝肾系数、结肠系数和组织病理学切片 取出小鼠肝肾和结肠，做好称重记录。结肠系数=结肠长度/体重；肝肾系数=肝肾质量/体重。结肠病理切片的石蜡包埋、切片、HE染色等工作由济南赛维尔公司完成。

1.3.5 炎症因子和肝肾功能因子测定 小鼠眼球取血，离心取血清-80 ℃保存备用，用于炎症因子和肝肾功能因子的测定，炎症因子的测定采用酶联免疫吸附试剂盒测定，肝肾功能因子肌酐、血尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶均采用试剂盒测定。

1.3.6 肠道菌群的测定 收集小鼠粪便进行16S rRNA V4区扩增构建测序文库，相关工作由天津诺禾致源生物信息科学有限公司完成。

1.3.7 统计学分析方法 采用IBM SPSS 24.0软件对组间数据进行比较分析，各组数据结果都以Mean±SD的形式表示，组内采用ANOVA单因素方差分析，P≤0.05，表示有显著性差异。运用GraphPad Prism 8.0进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 鱼腥草总黄酮的制备及检测 本实验以鱼腥草叶片纯提取物为原料，采用HPLC对鱼腥草总黄酮提取物与芦丁标准品进行检测。在283 nm处，芦丁标准品100 mg·L-1的保留时间在14.764 min，鱼腥草总黄酮提取物保留时间在13.249 min，可以判断鱼腥草总黄酮中含有芦丁这种物质，并且根据峰形可看出，提取效果良好。图1～2为芦丁标准液与鱼腥草总黄酮对照色谱。

图1 芦丁标准品色谱图

图2 鱼腥草总黄酮提取物芦丁成分色谱图

2.2 小鼠体重变化及DAI指数测定 表1为图1对应的小鼠体重变化数据。建模成功后，从第13天开始给药，第15天、第18天时，与治疗组小鼠相比较，DSS模型组小鼠的体重极显著下降，空白对照组与DSS模型组相比，体重极显著增加(见图3)，P<0.01。其中，鱼腥草总黄酮中、高剂量在改善体重下降的治疗效果上没有显著差异，鱼腥草总黄酮高剂量比芦丁改善效果好，但不如SASP效果好。可见鱼腥草总黄酮对DSS诱导小鼠肠炎所致的体重下降有一定的改善作用。

表1 小鼠体重变化(Mean±SD，n=10)

图3 小鼠体重变化

由图4可知，鱼腥草总黄酮中、高剂量治疗组的小鼠DAI评分相比DSS模型组小鼠显著降低，并且具有统计学意义(P<0.05)；芦丁组和SASP组小鼠DAI评分极显著降低(P<0.01)。但鱼腥草总黄酮中、高剂量组的DAI评分与芦丁组DAI评分差异不显著，因此可判断总黄酮在治疗DSS小鼠肠炎的过程中效果与芦丁相当。

图4 鱼腥草总黄酮对小鼠DAI指数的影响

2.3 结肠外观和结肠系数 由图5可知，鱼腥草总黄酮可以改善DSS导致的结肠肿胀，并且可以显著减少DSS小鼠结肠缩短的程度(P<0.05)。由图6可知，与DSS组相比，鱼腥草总黄酮高剂量组的结肠系数降低有统计学差异(P<0.01)；鱼腥草总黄酮中剂量组的结肠系数降低有统计学差异(P<0.05)。

图5 鱼腥草总黄酮对小鼠结肠外观形态的影响

图6 鱼腥草总黄酮对小鼠结肠系数的影响(Mean±SD，n=10)

2.4 肝肾系数 由图7可知，DSS诱导的小鼠肝肾系数会极显著增加(P<0.01)，SASP组略高于空白对照组，考虑到可能是连续服用SASP产生的副产物对小鼠肝肾代谢带来多余的负担，使得SASP组的肝肾系数相对增加。

2.5 组织病理学切片 从图8肠切片可以看出，DSS模型组肠黏膜外壁和内壁厚薄不均，黏膜内层有溃疡面形成，炎性细胞增多，隠窝变形粘连；空白组小鼠肠黏膜完整且上皮排列有序，无炎性细胞浸润，隠窝清晰；中剂量黄酮组还存在着少量的溃疡面和炎性细胞浸润，相比DSS组病变程度减轻了很多；高剂量黄酮组未见明显的溃疡面，隠窝结构和黏膜壁厚度也较为清晰，但是恢复效果不如SASP组，芦丁组切片中，还存在着少量的炎性细胞，但是腺体结构较为完整，比中剂量组要改善很多。这说明鱼腥草总黄酮可以改善DSS诱导的结肠溃疡，并且治疗效果呈剂量依赖关系。

图8 小鼠结肠病理组织切片分析

2.6 炎症因子 由表2所示，DSS模型组中IFN-γ、IL-1α、IP10和TNF-α 4种炎症因子的含量都远高于空白对照组，统计分析，两组之间差异极显著P<0.01；对比给药组和DSS模型组可以发现，给药组的炎症因子含量要低于DSS模型组，并且差异极显著，P<0.01；但是给药组炎症因子含量整体水平都要高于空白对照组，其中鱼腥草总黄酮高剂量组和SASP组降低炎症因子的效果较好。

表2 TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ水平

2.7 肝肾功能因子 由表3所示，DSS模型组在ALT、AST、CR和BUN水平上表达量上调，并且显著高于空白对照组，两组之间差异极显著，P<0.01；对比给药组和DSS组，可以发现，鱼腥草总黄酮中、高剂量组在ALT、AST、CR水平上，极显著低于DSS模型组，P<0.01；在BUN水平上，鱼腥草总黄酮高剂量组显著低于DSS模型组，P<0.05；SASP组在ALT和CR水平上略高于给药组，考虑可能为SASP对肝肾带来的副作用。结果表明，鱼腥草总黄酮可以减轻DSS带来的小鼠肝肾指标异常，对肝肾起到了一定的保护作用。

表3 小鼠血清中ALT、AST、CR和BUN水平检测

2.8 肠道菌群的测定 从图9可看出，样品量较少时，箱型图的增势较陡，表明样本量不足，不能完全反应物种丰富度，但随着样本量的增多，箱型图陡势减弱并逐渐趋于平缓，表明样本量充足，没有新的物种出现，可以进行样本分析。

图9 物种累积箱型图

拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)均为优势菌群，它们是肠道内普遍存在的主要菌群。由图10表明，与空白对照组相比，其他组的厚壁菌门所占肠道菌群的比例显著减小，而拟杆菌门和变形菌门占比增加。除DSS组以外，可以直观地看到鱼腥草总黄酮中、高剂量组的肠道菌群构成比例接近空白对照组，可见鱼腥草总黄酮可以改善小鼠肠道内菌群的分布。其中G2改善效果最好，其次是G1，最后是G3。SASP虽然可以治疗小鼠结肠炎，但对小鼠肠道菌群的分布有不利的影响，这一点可以看鱼腥草总黄酮在治疗肠炎和改善肠道内菌群分布具有一定的优势。

图10 小鼠肠道菌群门水平上的物种相对丰度柱形图

3 结论

近年来，黄酮类化合物因其抗炎、抗氧化和增强机体免疫机能等活性[19]，在防治溃疡性结肠炎方面逐渐成为研究的热点。本实验探索了鱼腥草总黄酮对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。综上所述，鱼腥草总黄酮提取物可有效改善结肠炎造成的小鼠体重下降、便血、肠梗阻和肠黏膜损伤等病理现象，降低疾病指数、结肠系数和肝肾系数，有效抑制炎症因子和肝肾因子的提高，并且在一定程度上呈剂量依赖性。另外通过小鼠肠道菌群宏基因组分析可得，鱼腥草总黄酮可以从不同程度上改善菌群种类的比例分布，维持肠道微生态稳定。因此，鱼腥草总黄酮的作用机制可能是抑制炎症因子的表达量上调，调节肠道微生态紊乱，其具体的作用机制需要进一步研究与证实。这些发现为进一步研究鱼腥草黄酮的药理作用提供了新的思路，同时鱼腥草是一种药食同源的植物，种植成本低且几乎无毒副作用。因此，鱼腥草黄酮可以作为一种新的结肠炎防治候选药物进行开发利用。