同时测定血浆血管紧张素Ⅰ、Ⅱ和醛固酮的液相色谱串联质谱法的建立与评价

于蕾，胡滨，吴洁，李倩倩，陈宝荣（.北京金域医学检验实验室有限公司实验诊断部，北京 000；.北京化工大学化学学院，北京 0009；.沃特世科技（北京）有限公司，北京 0076）

继发性高血压的精准诊断是高血压诊疗的难点。2020年王梦琳等［1］报道我国高血压专科患者中继发性高血压占39.26%。原发性醛固酮增多症（primary aldosteronism，PA）是最常见的继发性高血压疾病之一［2-3］。《原发性醛固酮增多症诊断治疗的专家共识（2020版）》推荐ARR为PA筛查的首选指标［2］。ARR包括醛固酮（aldosterone，Aldo）与血浆肾素活性的比值和醛固酮与血浆肾素浓度的比值两种形式。放射免疫分析法（RIA）测定的是肾素活性，即单位时间内血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ的水平，间接反映血浆中肾素活性水平。化学发光法测定的是肾素浓度。根据RAAS血压调控机制和既往研究，血管紧张素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和Aldo是PA等继发性高血压筛查和鉴别诊断的主要实验室依据［4］。

既往AngⅠ和Aldo的检测方法包括RIA、化学发光法（CLIA）、高效液相色谱法等［4-6］，而AngⅡ的检测方法主要是RIA［6］。由于免疫学方法测定上述激素存在非特异性干扰，van der Gugten等［7］建立了液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）测定AngⅠ的方法，Meunier等［8］建立了LC-MS/MS测定血浆Aldo的方法。受技术发展的限制，直至2021年，Chen等［9］采用LC-MS/MS建立了同时检测肾素活性、AngⅡ和Aldo的方法。鉴于AngⅠ、AngⅡ和Aldo对PA鉴别诊断的重要价值，本实验室在充分研究AngⅠ、AngⅡ和Aldo分子结构与测量特性的基础上，建立了一种新的可同时检测上述3种重要血浆成分的LC-MS/MS方法，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 超高效液相色谱串联Xevo TQ-S质谱仪（美国Waters公司）；AcquityTMpremier HSS T3色谱柱（100×2.1 mm，1.8μm，美国Waters公司）；96孔固相萃取SPE板（Oasis MAXμElution SPE，美国Waters公司）；Eppendorf手动移液器（德国Eppendorf公司）。

标准品为AngⅠ（纯度＞99%，批号20202120-4，上海谱芬公司）、AngⅡ（纯度＞99%，批号2020421-4，上海谱芬公司）、Aldo（纯度＞99.1%，批号FN05141904，美国Cerilliant公司）；内标品为AngⅠ-［13C6，15N］（纯度≥95%，批号1756675，美国Anaspec公司）、AngⅡ-［13C6，15N］（纯度≥95%，批号1955630，美国Anaspec公司）、Aldo-［2H7］（纯度≥98%，批号PG1-2019-216A1，美国Isosciences公司）。甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇均为HPLC级，购自德国Merck公司；氨水（优级纯，国药集团化学试剂公司）、水为一次蒸馏水；牛血清清蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲液（PBS）、大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 BSA缓冲液和温育液配制

1.2.1 BSA缓冲液配制 精密称量0.1 g BSA加入10 mL 0.01 mol/L的PBS缓冲液中，配制成浓度为10 mg/mL的BSA缓冲液。

1.2.2 温育液配制 称取7.40 g EDTA、12.11 g Tris-base、0.063 g PMSF和0.01 mg SBTI，加入90 mL蒸馏水溶解，用乙酸调节pH为5.4～5.5。

1.3 标准曲线和内标液配制

1.3.1 标准曲线配制

1.3.1.1 单一标准品储备液配制 用十万分之一精密电子天平分别称取AngⅠ、AngⅡ和Aldo标准品各0.02 mg，移液器准确加入1 mL 20%乙腈溶解，配制浓度均为20μg/mL的单一标准品储备液。

1.3.1.2 混合标准品储备液配制 移取不同体积的单一标准品储备液，20%乙腈稀释得到AngⅠ、AngⅡ、Aldo浓度为10、0.1、1μg/mL的混合标准品储备液。

1.3.1.3 S1～S10标准曲线配制 用BSA缓冲液将混合标准品储备液倍比稀释至10个浓度，AngⅠ浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL；AngⅡ为0、0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500、1.000 ng/mL；Aldo为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL。

1.3.2 内标液配制

1.3.2.1 单一内标储备液配制 称取AngⅠ-［13C6，15N］、AngⅡ-［13C6，15N］和AngⅡ-［13C6，15N］各0.01 mg，移液器取1 mL 20%乙腈溶解，配制浓度均为10μg/mL的单内标储备液。

1.3.2.2 混合内标储备液配制 移取不同体积的单内标储备液，20%乙腈稀释得到3种化合物对应内标浓度为50、20、500 ng/mL的混合内标储备液。1.3.2.3 内标工作液配制 用20%乙腈稀释混合内标储备液至AngⅠ-［13C6，15N］、AngⅡ-［13C6，15N］、Aldo-［13C6，15N］浓度为0.5、0.2、5 ng/mL的内标工作液。

1.4 样本前处理

1.4.1 预处理样本 分别取200μL待测样本，加入200μL温育液，在37℃温育3 h后加300μL内标工作液，得到预处理样本。

1.4.2 固相萃取 在96孔正压装置上，用200μL含1%甲酸的50%乙腈水溶液活化SPE板。取550 μL预处理样本至SPE板上，然后加200μL含1%氨水的10%甲醇洗涤杂质。接着将SPE板下方的废液板更换为96孔样品板，用40μL含1%甲酸的50%乙腈水溶液洗脱待测物并收集至样品板待测。

1.5 LC-MS/MS分析

1.5.1 色谱条件 色谱柱：AcquityTMpremier HSS T3；柱温：40℃；进样量：15μL；运行时间：5 min；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速0.4 mL/min的液相梯度见表1。

表1 流动相梯度

1.5.2 质谱条件 质谱分析采用电喷雾离子源（ESI）；监测模式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：1.00 kV；离子源温度：50℃；去溶剂气温度：550℃；去溶剂气流速：1 100 L/h。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的定量监测离子对质荷比（m/z）分别为：433.1＞619.4、349.8＞136.1、359.2＞331.1，对应内标品定量离子对（m/z）分别为：435.4＞625.5、352.1＞136.2、367.3＞339.2；碰撞电压：30 V。

1.6 方法学性能评价 根据《液相色谱-质谱临床应用建议》［10］对建立的方法进行性能评价。

1.6.1 线性 取10个浓度点的标准曲线S1～S10，按1.4样本前处理后，重复检测3次。使用多元回归方程评价线性，记录线性方程和相关系数（r）。各浓度点实测值与理论值偏差＜15%，CV＜15%且r＞0.998，可用于样本定量。

1.6.2 检出限（LOD）和定量限（LOQ） LOD是指方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度，而LOQ是方法能准确检测的最低浓度。选择AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度分别为0.1、0.001、0.01 ng/mL，0.2、0.002、0.02 ng/mL，0.5、0.005、0.05 ng/mL的3个低浓度水平样本进行测定，每个浓度水平的样本重复检测10次。信噪比＞3的最低浓度为本法的LOD。若同时满足信噪比＞10且连续进样CV＜15%的最低浓度为本法的LOQ。

1.6.3 回收率 在正常人低值血浆中分别添加不同浓度的AngⅠ、AngⅡ和Aldo标准品，制备3个不同浓度水平的待测样本。其中，AngⅠ的浓度分别为5.0、20.0、50.0 ng/mL；AngⅡ的浓度分别为0.020、0.080、0.200 ng/mL；Aldo的浓度分别为0.10、0.40、1.00 ng/mL。在同一天内完成3个浓度样本、每个浓度样本重复6次的检测，并同时测定空白血浆浓度。每个样本按实测浓度/理论浓度×100%计算回收率。

1.6.4 实验室间比对 采用本法检测2021年国家卫生健康委临床检验中心室间质评样本202112、202114、202115的AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度。根据给定的质谱法靶值（多家实验室测定结果的稳健均值）判断本室测量结果的准确性。

1.6.5 精密度 根据《液相色谱-质谱临床应用建议》［10］，测定低、中、高3个浓度水平样本进行精密度评估。每个浓度水平样本每天测量5次，连续测3天，计算同一批次内5个样本（批内）和3个批次（批间）的变异系数CV。建议CV应＜15%。

1.6.6 基质效应 选取5人血浆和溶剂基质，前处理后分别添加低、高浓度标准品。其中，溶剂基质为20%乙腈，添加的AngⅠ、AngⅡ、Aldo低浓度标准品为5.0、0.050、0.50 ng/mL，高浓度为50.0、0.500、5.00 ng/mL。此外，向上述样本中均加入相同体积的内标工作液。经内标校正后，若血浆基质与溶剂基质的信号比值在85%～115%范围，可认为无明显基质效应。

1.6.7 携带污染 即评估高值样本对低值样本的影响。其中，高值样本AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度分别为：50.0、0.500、5.00 ng/mL，低值样本为：0.2、0.002、0.020 ng/mL。首先低值样本连续进样5次，然后高、低样本交替进样5次。计算连续进样和交替进样的低值样本的差值，应小于连续进样的3倍标准差（SD）。

1.6.8 冻融次数 样本多次冻融可能会影响实验结果，因此进行样本的反复冻融实验。选取4例临床样本，分别进行冻融1、2、3次实验，查看样本反复冻融对结果的影响。

1.6.9 参考区间验证 随机选择25名无血压增高的健康志愿者，男性11名，女性14名，年龄23～43岁。采集清晨空腹静脉血到EDTA-K2抗凝管中，并立即离心（25℃，10 min，离心力1 000×g），采用LC-MS/MS法检测各血浆样本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度。

2 结果

2.1 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的代表色谱图 血浆中AngⅠ、AngⅡ和Aldo的色谱图见图1，该方法分析时间为5 min。AngⅠ、AngⅡ和Aldo能有效分离，峰型对称，保留时间分别为1.93、1.83和3.33 min。

图1 AngⅠ、AngⅡ和Aldo色谱图

2.2 线性 将AngⅠ、AngⅡ及Aldo的10个浓度标准曲线点S1～S10采用本法检测，AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度范围分别为0.2～50.0 ng/mL、0.002～0.500 ng/mL、0.02～5.00 ng/mL时，各浓度点实测值与理论值偏差均＜10%且CV＜15%。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的拟合线性方程为：y＝0.803x+0.021、y＝0.003x-0.001和y＝0.003x（r＝0.999，P＜0.001），线性评价通过。

2.3 LOD和LOQ 样本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度为0.1、0.001、0.01 ng/mL时，信噪比均＞3，该浓度为本法的LOD。而样本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo浓度为0.2、0.002、0.02 ng/mL时，连续进样10次，信噪比均＞20且同时满足连续进样CV为1.8%～9.8%，该浓度为本法的LOQ。

2.4 回收率 采用本法测定血基质空白、低、中、高浓度样本，去除空白样本浓度后，AngⅠ、AngⅡ、Aldo的加标回收率分别为91%～95%、98%～103%、91%～93%。加标回收率均在85%～115%之间，结果见表2。

表2 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的加标回收率

2.5 实验室间比对 采用本方法测定国家卫生健康委临床检验中心2021年室间质评3个样本202112、202114、202115，本方法AngⅠ、AngⅡ和Aldo检测值与靶值偏差为-9.7%～7.2%，检测结果全部在国家卫生健康委临床检验中心给定的等效范围内（见表3）。

表3 实验室间比对结果

2.6 精密度 对低、中、高3个不同浓度的样本连续检测3 d、每天检测5个平行样本，结果见表4。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的批内CV分别为1.4%～3.6%、2.2%～5.1%、2.4%～3.3%；批间CV分别为1.5%～4.6%、2.1%～4.4%、3.0%～5.2%，本法精密度良好。

表4 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的精密度

2.7 基质效应 通过内标校正后，5名研究对象血浆基质与溶剂基质的信号比值分别为85%～100%（AngⅠ）、90%～109%（AngⅡ）、106%～114%（Aldo），均在85%～115%范围。表明加入内标品后，可有效补偿基质增强或抑制，该方法无明显基质效应。

2.8 携带污染 AngⅠ低值样本连续进样和高、低值样本交替进样峰面积差值为173.2，小于连续进样的3SD（227.6）。因此，当AngⅠ样本浓度低于50 ng/mL时，携带污染可忽略。而AngⅡ和Aldo无携带污染。

2.9 样本冻融次数 进行样本反复冻融实验，以4例临床样本AngⅠ、AngⅡ和Aldo的浓度平均值随冻融次数的变化，评估反复冻融对检测结果的影响。对于AngⅠ和Aldo，样本冻融2次和3次，浓度变化均在1.5%以内，无明显差异。而AngⅡ，样本冻融2次变化较小；样本冻融3次，结果明显降低29.5%。因此，建议样本冻融次数不超过2次。

2.10 参考区间验证 对临床表观正常、无RAAS相关基础疾病的25名健康志愿者样本采用该方法进行检测，所有人均为坐位采血。检测结果如下：成人血浆中AngⅠ、AngⅡ、Aldo的浓度范围分别为1.4～11.8 ng/mL、0.003～0.016 ng/mL、0.02～0.20 ng/mL。肾素活性0.47～3.95 ng·mL-1·h-1，与徐雯等［11］建立的参考区间（0.25～5.12 ng·mL-1·h-1）一致。AngⅡ浓度与美国实验室Mayo Clinic参考区间0.005～0.040 ng/mL对应［12］。Aldo浓度也与Meunier等［8］测定范围（0.02～0.23 ng/mL）相符。

3 讨论

采用不同的测量原理、不同方法学测量RAAS的3个激素时，由于使用非同源测量方法常导致临床测量结果合理分析、正确使用难度大。因此，血浆AngⅠ、AngⅡ和Aldo同时检测一直是临床实验室的期望。受测量技术、仪器性能等的影响，既往一个方法一般仅能检测其中一项。首先，AngⅠ、AngⅡ和Aldo化学性质差异较大，AngⅠ和AngⅡ为生物大分子且电离后为多电荷正离子，而Aldo为小分子且电离后为负离子，要将3种物质完全分离并达到检测质量要求，对检测仪器性能要求很高；其次，AngⅡ在血浆中含量极低，约5～40 pg/mL，检测困难；此外，AngⅠ和AngⅡ均为分子量1 000以上的多肽类物质，极易与常规使用的C8色谱柱等发生吸附作用，因此在检测前需耗费大量的时间平衡色谱柱。本研究通过优选色谱柱、色谱条件和离子对筛选目标化合物，并采用正负离子切换模式进行检测，在有效分离3种化合物的同时实现样本中AngⅡ检测浓度低至2 pg/mL的准确测量。

与中山医院2021年建立的同时测定肾素活性、AngⅡ和Aldo的方法［9］比较，本研究采用TQ-S质谱仪，通过优化测量条件以及选用专为AngⅠ、AngⅡ等多肽大分子设计的AcquityTMpremier新型色谱柱，灵敏度显著提高。在血浆使用量仅200μL条件下，AngⅠ的LOQ 0.2 ng/mL（比较方法0.33 ng/mL）、AngⅡ的LOQ 0.002 ng/mL（比较方法0.015 ng/mL），能更好地满足临床检测需求。

RIA曾经作为肾素活性检测的“金标准”，可检测肾素的范围是0.2～6.0 ng·mL-1·h-1［13］。而本研究AngⅠ的线性范围为0.2～50.0 ng/mL，本方法可检测的肾素活性范围为0.07～16.7 ng·mL-1·h-1。对于AngⅡ和Aldo，CLIA可检测的线性范围均为0.01～1.00 ng/mL，而LC-MS/MS分别为0.002～0.500 ng/mL和0.02～5.00 ng/mL。对比可知，本研究建立的LC-MS/MS新方法不仅实现了AngⅠ、AngⅡ和Aldo的同时准确测量，也较传统方法的检测范围更宽、灵敏度更高。

本方法通过超高效液相分离技术有效分离待测物，通过同位素内标品和标准品进行校正，保证检测结果的准确性，方法加标回收率在89%～102%之间。检测国家卫生健康委临床检验中心实验室间质量评价样本，其结果表明本法与其他同类实验室测量结果一致性好。另外，采用本法测量了25名健康成人血浆中AngⅠ、AngⅡ、Aldo浓度，结果与文献［8，11-12］报道一致。鉴于本法测量原理可靠，其在测量性能方面已展现出的良好性能，未来是否能助力PA的实验室诊断的标准化，还有待进一步研究证实。