血清总胆红素改良参考测量程序的复现及性能评价

李敏，孟祥兆，孙江漫，邵燕，于洪远（北京航天总医院检验科，北京 100076）

总胆红素是医学实验室肝功能检查的重要常规项目，其结果有助于临床医生判断患者肝脏功能、黄疸程度及类型等［1］。Doumas等开发的检测总胆红素的参考方法已获得国际认可，该方法建议使用NIST的标准物质SRM916a作为一级参考物质进行校准。目前，SRM916a已经停产，这种状态阻碍了总胆红素的标准化进程。德国汉诺威临床化学研究所在Doumas参考方法的基础上进行改良，改良参考测量程序不再依赖标准物质进行校准。本研究通过复现血清总胆红素的改良参考测量程序，并对其各项性能进行评估，观察其是否可实现临床常规实验室总胆红素检测结果的量值溯源和标准化。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 Cary100紫外-可见分光光度计（安捷伦公司），LA120S型电子天平（赛多利斯公司），reference移液器（艾本德公司），Microlab-500型稀释配液仪（Hamilton公司），Milli-Q纯水机（密理博公司）。

对氨基苯磺酸（批号：BCBJ0170V）、亚硝酸钠（批 号：1389022）、四 水 酒 石 酸 钾 纳（批 号：SLBD8827V）、氢氧化钠（批号：BCBH5016）、安息香酸钠（批 号：SLBC8803V）、EDTA-Na2（批 号：1205337）、醋酸钠（批号：SZBF2210V）（Sigma公司），咖啡因（批号：007913275）购自（AMRESCO公司）。

1.2 标本来源 （1）2020年国际参考实验室比对标本20RELA-A、20RELA-B，合格范围分别为（53.50±2.94）μmol/L、（22.43±1.23）μmol/L，胆红素国家一级标准物质GBW09184、GBW09185（有效期2021年12月），靶值±不确定度范围分别为（108.10±1.9）μmol/L、（44.60±0.8）μmol/L（k＝2），均用于方法的正确度评价；（2）收集北京航天总医院住院患者血清，无肉眼可见的溶血和乳糜，用于方法的精密度和线性评价。

1.3 方法

1.3.1 反应原理 在咖啡因试剂的存在下，胆红素与重氮试剂反应生成偶氮胆红素，酸性条件下呈红色，碱性酒石酸使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，最大吸收峰由530 nm转移至598 nm，该波长下偶氮化合物的吸光度与胆红素浓度呈正比。

1.3.2 试剂配制与检测 依据参考文献［2］中的内容配制相关试剂，包括咖啡因试剂、碱性酒石酸、亚硝酸钠溶液、对氨基苯磺酸溶液、重氮试剂。实验室测量条件：温度25℃；波长598 nm；光谱带宽2 nm；光径10.0 mm。具体检测步骤如下：1 mL的咖啡因试剂和0.2 mL的待测标本同时加入测量管和空白管，室温下充分混匀，静置10 min。测量管和空白管中分别加入0.5 mL的重氮试剂和对氨基苯磺酸，室温下充分混匀，静置10 min。最后，测试管和空白管中均加入1 mL的碱性酒石酸，室温下充分混匀，静置10 min后在598 nm处检测吸光度。

1.3.3 测量结果的计算 血清总胆红素含量是由空白吸光度修正后的最终反应混合物的吸光度总和乘以因子F计算得出，具体公式见公式1。

式中ε为摩尔吸光系数（7 649 m2/mol）［3］，d为比色杯光径（0.01 m），v为样本的体积分数（0.074 04），f为mol/m3到μmol/L的单位转换系数（1 000），Atotal为最终完全反应混合物在598 nm处的吸光度，Ablank为空白溶液在598 nm处的吸光度，经计算F因子＝176.5。空白管与测量管相比，除了用对氨基苯磺酸代替重氮试剂，其他添加试剂和反应条件均相同。

1.4 性能评价

1.4.1 正确度 采用改良的参考测量程序检测国家一级标准物质和RELA比对标本，每个标本重复测量3次，计算平均值，比较均值与靶值/认定值的偏倚。

1.4.2 精密度 取3份不同浓度梯度的血清标本，每天每个浓度标本测量5次，连续测量5 d，各25个检测结果，计算总CV。

1.4.3 线性 参考美国临床实验室标准化研究所的EP-6A文件，收集本院高值（H）胆红素血清样本，低值（L）血清样本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H的比例配制6个浓度标本，按随机顺序对每个浓度的标本进行测定，重复3次，所有数据进行拟合多项式回归分析。

1.4.4 不确定度 根据《测量不确定度表示指南》，识别测量结果各不确定度分量来源，对各分量分别进行评定，计算相对扩展不确定度。

1.4.5 方法学比对 采用改良参考测量程序和Doumas方法测定40份新鲜冰冻人血清标本中的总胆红素，浓度范围为10～240μmol/L，选取最佳拟合模型进行回归分析，计算回归方程及各项参数。

1.5 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件和Microsoft Excel 2003进行统计分析。

2 结果

2.1 正确度评价 改良参考测量程序对标准物质和RELA样本的检测结果见表1，所有测量值均在合格范围内，偏倚均小于1.5%。

表1 总胆红素正确度评价结果

2.2 精密度评价 3个浓度水平的血清标本连续测量5 d结果的总CV均小于1.5%，见表2。

表2 总胆红素精密度评价结果

2.3 线性评价 使用改良的参考测量程序检测6个浓度梯度的标本，结果见表3。对所得数据进行多项式回归分析处理。通过对结果分析可知，二次和三次回归多项式中的非线性参数与0相比差异无统计学意义（P＞0.05），实验数据最适拟合模型为一次多项式，总胆红素在11.55～443.96μmol/L的范围内呈线性。

表3 总胆红素线性评价测量结果

2.4 不确定度评价 建立评定总胆红素测量不确定度的模型，见公式1。识别不确定度来源，考虑影响测量结果的所有因素，将其绘制成因果关系图，见图1。识别不确定度来源后，量化这些不确定度来源所产生的不确定度分量。经分析，波长、吸光度、测量温度、延迟时间、样本体积分数等是影响总胆红素测量不确定度的主要分量。通过对不确定度分量的合成，计算合成不确定度及相对扩展不确定度，见表4。

表4 不确定度评价结果

图1 不确定度来源的因果关系图

2.5 方法学比对 以Doumas参考方法的测定结果为X轴，改良参考测量程序的测定结果为Y轴，对两种方法采用Passing-Bablok回归分析。线性回归方程为Y＝0.029 9+1.001X，斜率的95%CI为0.995 8～1.004 6，截距的95%CI为-0.197 2～0.187 5，相关系数r＝0.999，回归线显示斜率与1、截距与0无显著偏差，因此两种方法测量结果之间差异无统计学意义。

3 讨论

虽然总胆红素的Doumas参考方法已获得美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的批准，但是官方认可的总胆红素参考测量实验室网络仍然缺失，其中很大的原因是由于NIST提供的标准物质SRM916a无法持续供应。因此，避免使用916a进行校准，有利于优化测量程序的性能并消除相关的不确定度因素。

本研究依据相关文件复现总胆红素改良参考测量程序，与传统的Doumas参考方法相比有以下几点不同：（1）使用摩尔吸光系数代替标准物质进行校准，无需制作标准曲线。经典的Doumas参考方法的难点之一是标准曲线的制作，用NIST916a配制200 mg/L总胆红素标准原液并在598 nm处测定摩尔吸光系数ε，若ε满足证书要求，则可以将原液稀释成系列浓度的标准曲线。Lo等［4］的总胆红素室间比对表明使用摩尔吸光系数代替标准物质进行校准，有助于推动总胆红素测量标准化的进程。（2）样本量从0.5 mL减少到0.2 mL，最终反应混合物的体积从8.5 mL减少到2.7 mL，有利于小体积患者标本的测量。（3）传统方法对总胆红素的测量上限为261μmol/L，改良后的程序提供了更高的测量范围，经实验数据验证，测量上限可达443.96μmol/L。（4）不确定度分量的来源发生变化。Doumas参考方法中校准曲线斜率和截距、标准原液的配制是主要的不确定度分量来源，改良后的参考测量程序消除了校准曲线引入的不确定度分量。

对于改良参考测量程序，本研究未对可能的干扰因素进行研究，如标本中血红蛋白浓度、锌的浓度、光照强度的影响等，我们将在后续的实验中及时补充相关数据。