HKαα及其复合-α4.2缺失型α地中海贫血的临床分析*

马晨骁，肖 璇，李树全，陈 萍，张 学△

（1.广西医科大学第一附属医院儿科，南宁 530021；2.国家卫生健康委地中海贫血防治重点实验室，南宁 530021；3.中国医学科学院地中海贫血防治研究重点实验室，南宁 530021；4.广西医科大学广西地中海贫血防治重点实验室，南宁 530021）

α 珠蛋白三联体是一种多拷贝变异体，可以通过基因的剂量效应影响地中海贫血的表型，由16号染色体α珠蛋白基因簇的同源序列发生不等交换时产生，主要包括两种类型：αααanti3.7和αααanti4.2。当重组发生于X同源盒时，可使一条16号染色体缺失了4.2 kb（-α4.2），另一条染色体则形成α-珠蛋白三联体（αααanti4.2）；当重组发生在Z 同源盒时，则分别形成3.7 kb缺失（-α3.7）和另一种α-珠蛋白三联体（αααanti3.7）[1]。当α珠蛋白三联体αααanti4.2与-α3.7发生不等交换时可形成HKαα，又称香港型地中海贫血[2]。HKαα基因由α2基因、X1与X2形成的融合基因以及由α2与α1形成的融合基因（-α3.7）三部分组成，是一种罕见的α地贫重组基因[3]。临床常用的常规缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒无法检测出HKαα，易发生漏诊和误诊。目前国内、外关于HKαα 的报道多为HKαα/αα 及HKαα 复合东南亚型缺失α 地中海贫血（HKαα/--SEA）。本文报道罕见的HKαα 复合-α4.2 缺失型α 地中海贫血（HKαα/-α4.2）病例的临床和血液学特征，以期为临床诊疗和遗传咨询提供依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集2021 年5 月至2022 年3 月在广西医科大学第一附属医院进行地中海贫血检测的165 例患者，其中-α3.7 和-α4.2 缺失型α 地中海贫血杂合子90 例，--SEA/-α3.7及--SEA/-α4.2缺失型Hb H 病75 例。165例中，男59例，女106例，年龄1个月至89岁。

1.2 血常规分析

采集静脉血2 mL，收集于含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管中。用血细胞自动分析仪（CELL-DYN1700，雅培公司，美国）对样本进行血常规检测，包括红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血细胞比容（HCT）、红细胞体积分布宽度（RDW）等。

1.3 Hb分析

采用高效液相色谱仪（Hb Variant Ⅱ，Bio-Rad,美国）对全血中的Hb H、Hb A2、Hb F进行定量分析。

1.4 DNA提取

用核酸自动提取仪（Lab-Aid 820，厦门百维信生物科技有限公司）应用磁珠法基因组DNA提取技术从外周静脉血中提取DNA。提取的DNA经紫外分光光度计（Nanodrop 2000/2000CC，赛默飞公司,美国）测定样本浓度和纯度合格后，装于1.5 mL 离心管中于-20 ℃冰箱保存。

1.5 α地中海贫血基因突变分析

1.5.1 常见的缺失型α-地中海贫血基因突变检测

采用跨越断裂点聚合酶链反应（Gap-PCR）技术检测4 种常见的缺失型α-地中海贫血基因突变：--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI（缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒，深圳市亿立方生物技术公司）。PCR扩增：在21 μL PCR反应液中加入3 μL DNA样本及1 μL 双蒸馏水，构成25 μL 的反应体系。PCR 反应条件：经50 ℃预热5 min，96 ℃预变性5 min 后；98 ℃变性45 s，64 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共35 个循环；最后72 ℃继续延伸10 min（PROFLEX BASE，LifeTechnologies，美国）。PCR 反应产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳50 min 后在凝胶成像系统（GeldocXR+，Bio-Rad，美国）上拍照、记录。

1.5.2 常见的非缺失型α-地中海贫血基因突变检测

采用荧光PCR 熔解曲线法（FCMA）检测α-地贫3种常见的非缺失型α-地中海贫血基因突变：Hb CS、Hb QS、Hb WS（非缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒，厦门致善生物科技公司）。采用FCMA技术在全自动医用PCR分析系统（SLAN-96S，上海宏石医疗科技公司）扩增。在19.8 μL PCR 反应液中加入5 μL DNA 样本及0.2 μL 酶混合液，构成25 μL的反应体系。PCR反应程序：经50 ℃UNG酶处理2 min，95 ℃预变性10 min后；95 ℃30 s，70 ℃15 s（每个循环下降1 ℃），76 ℃20 s，共10个降落循环；95 ℃15 s，55 ℃15 s，76 ℃20 s，共50个PCR循环。严格按说明书对实验结果进行判读。

1.5.3 αααanti4.2基因检测 引物设计按参考文献[4]。共有两对引物，一对引物用于扩增X1/X2融合片段：AT4.2-F、AT4.2-R；另一对引物用于扩增位于非翻译区的LIS1基因：LIS1-2.5。X1/X2 融合片段的上游引物AT4.2：5’-CCTTGCACCGGCCCTTCCTG-3’，下游引物AT4.2：5’-GAACTGGCTGAAAGGGATGCAG-3’；LIS1基因的上游引物LIS1-2.5：5’-GTCGTCACTGGCAGCGTAGATC-3’，下游引物LIS1-2.5：5’-GATTCCAGGTTGTAGACGGACTG-3’（引物由上海生物工程技术有限公司合成）。应用Gap-PCR 在PCR 扩增仪上（PROFLEX BASE，LifeTechnologies，美国）扩增。PCR 反应体系：200 μmol/Ld NTP、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 U TaqDNA 聚合酶、200 ng DNA 样本、0.5 μmol/L 引物、PCR 反应缓冲液。PCR 反应条件：96 ℃预变性15 min；98 ℃变性45 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸135 s，共30个循环；72 ℃继续延伸5 min[5]。经1.2%的琼脂糖凝胶电泳30 min后在凝胶成像系统（GeldocXR+，Bio-Rad，美国）上拍照、记录。

1.6 β地中海贫血基因突变分析

采用荧光PCR 熔解曲线法（FCMA）检测21 种常见β-地贫的非缺失型基因突变：c.-78A＞G、c.-79A＞G、c.-80T＞C、c.-81A＞C、c.-82C＞A、c.-123A＞T、c.-140C＞T、c.45_46insG、c.48_49insG、C.52A＞T、c.79G＞A、c.91A＞G、c.92+1G＞T、c.92+5G＞C、c.84_85insC、c.113G＞A、c.216_217insA、c.130G＞T、c.315+5G＞C、c.316-197C＞T、c.124_127delTTCT（β-地贫基因诊断试剂盒，厦门致善生物科技公司）。采用FCMA技术在全自动医用PCR分析系统（SLAN-96S，上海宏石医疗科技公司）扩增。在19.8 μL HBB PCR Mix A/B 反应液中加入0.2 μL HBB酶混合液及5 μL DNA 样本，构成25 μL的反应体系。PCR 反应程序：经50 ℃预热5 min，95 ℃预变性10 min 后；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，76 ℃延伸20 s，共55 个循环。严格按说明书对实验结果进行判读。

2 结果

2.1 病例一般资料

在165例样本中检出1例基因型为HKαα/-α4.2，5 例基因型为HKαα 的患者。6 例患者均来自广西壮族自治区，HKαα/-α4.2患者为35 岁男性，5 例HKαα患者年龄25～32岁，患者均无贫血表现，无黄疸、肝脾肿大或输血史。-α3.7 和-α4.2 缺失型α 地中海贫血突变样本中的检出率均为3.03%。

2.2 血常规

基因型为HKαα/-α4.2的患者血常规结果：RBC 5.59×1012/L，Hb 166 g/L，MCV 88.60 fL，MCH 29.70 pg，MCHC 335.00 g/L。基因型为HKαα的5例患者血常规结果：RBC（4.77±0.26）×1012/L，Hb（135.68±4.37 ）g/L，MCV（86.25±4.05）fL，MCH（28.47±1.12）pg，MCHC（330.48±3.75）g/L。参数正常参考值范围：RBC（4.3～5.8）×1012/L，Hb 130～175 g/L，MCV 82.0～100.0 fL，MCH 27.0～34.0 pg，MCHC 316～354 g/L。

2.3 血红蛋白分析

Hb 分析显示，HKαα/-α4.2的患者：Hb A22.6%，Hb F 1.5%，未见异常Hb。5例基因型为HKαα的患者：Hb A2（2.84±0.05）%，Hb F（0.36±0.11）%，未见异常Hb。参数正常参考值范围：Hb A22.5%～3.5%，Hb F 0.0%～1.0%。

2.4 基因分析结果

2.4.1 缺失型α-地中海贫血基因突变检测结果

常见的非缺失型α-地中海贫血基因突变检测：检出67 例-α3.7 缺失型α 地中海贫血，16 例-α4.2 缺失型α地中海贫血，7例-α3.7缺失型复合-α4.2缺失型α 地中海贫血和75 例HbH 病（44 例--SEA/-α3.7，31例--SEA/-α4.2）。

HKαα/-α4.2的病例扩增出2.0 kb-α3.7缺失型突变，1.4 kb-α4.2基因突变，及1.7 kb αα；HKαα的病例扩增出2.0 kb-α3.7缺失型突变，及1.7 kb αα，结果见图1。

图1 Gap-PCR法检测缺失型α地中海贫血

2.4.2 非缺失型α-地中海贫血基因突变检测结果

所有病例均未检出Hb CS、Hb QS 和Hb WS 等非缺失型突变。

2.4.3 αααanti4.2基因检测结果 共检出6 例αααanti4.2病例，PCR 扩增产物显示1.7 kb αααanti4.2基因片段，及2.5 kb的正常α珠蛋白基因片段，见图2。

图2 αααanti4.2 PCR检测结果

2.4.4 β-地中海贫血基因突变检测结果

所有病例均未检测出β-地中海贫血基因突变。

3 讨论

α 地中海贫血是遗传性疾病，是一种由α 珠蛋白基因的缺陷导致血红蛋白中的α珠蛋白肽链合成减少甚至完全不能合成而形成的遗传性溶血性贫血。人类的α 珠蛋白基因簇位于16 号染色体的短臂末端（16p13.3）,每一条染色体各有2 个α 珠蛋白基因，一对染色体则共有4 个α 珠蛋白基因。α-珠蛋白基因簇的同源区段有X、Y、Z 盒，其中2 个Z 同源盒的间距为3.7 kb，2 个X 同源盒的间距为4.2 kb。当重组发生于Z 同源盒可形成α-珠蛋白三联体（αααanti3.7）。当重组发生于X 同源盒可形成另一种α-珠蛋白三联体（αααanti4.2）[4]。这两种三联体最早于1980年被报道[6]。因为基因数目在地中海贫血的表型调控中起着重要作用，α-珠蛋白三联体可以通过基因效应影响地中海贫血患者的表型。

HKαα为α珠蛋白三联体αααanti4.2与-α3.7发生不等交换时形成[7]。在广西地区人群中HKαα的携带率为0.16%[8]。与-α3.7相比，因为-α3.7只有一个α2与α1形成的融合基因，HKαα 除含有一个α2与α1形成的融合基因外，还有一个完整的α2基因。因此，HKαα 血液学表型优于-α3.7携带者[9]。目前关于HKαα的报道，被描述较多的为HKαα/αα及HKαα复合东南亚型缺失（HKαα/--SEA）。基因型为HKαα/αα 的个体多无贫血，血液学检测正常[9]。基因型为HKαα/--SEA的患者临床表型和--SEA/αα 极为相似，比HbH病（-α3.7/--SEA）症状轻[10-12]。

本研究在165 例含-α3.7 或-α4.2 缺失型α 地中海贫血突变的杂合子或Hb H病病例中，共检出5例HKαα 患者，检出率为3.03%，其血常规结果显示：RBC（4.77±0.26）×1012/L，Hb（135.68±4.37）g/L，MCV（86.25 ± 4.05）fL，MCH（28.47 ± 1.12）pg，MCHC（330.48±3.75）g/L。Hb 分析显示：Hb A2（2.84±0.05）%，Hb F（0.36±0.11）%。血液学检测各及血红蛋白分析各项指标正常，这一结果与以往姚亚超等[10]和Wu等[12]报道的结果相似。

HKαα/-α4.2地中海贫血病例较为罕见，目前国内、外仅报道8 例，其中6 例均有轻度贫血或MCV、MCH 降低，2 例病例无临床表现和血液学检查结果。如2015 年Wu 等[13]报道1 例28 岁基因型为HKαα/-α4.2的女性患者，血常规检测：Hb 136 g/L，MCV 78.30 fL，MCH 25.10 pg，Hb分析中HbA22.2%、Hb A2略降低，MCV、MCH低于正常值。2019年Wang 等[14]在广西桂林地区发现2 例基因型为HKαα/-α4.2的病例，其中1例9岁患者的血液学常规检测结果为Hb 126 g/L，MCV 74.20 fL，MCH 24.60 pg，Hb分析中Hb A22.9%。其MCV及MCH低于正常值。另一例为胎儿。2020 年刘沃满等[15]报道茂名地区3 例HKαα/-α4.2患者，血常规检测显示患者为轻度贫血[Hb（106.00±9.90）g/L，MCV（88.2±7.3）fL，MCH（28.2±2.4）pg]，Hb分析中HbA2（2.4±0.1）%。2021 年Long 等[8]在广西钦州地区发现了一例HKαα/-α4.2患者，未描述临床症状及血液学常规检测结果。

本研究的HKαα/-α4.2病例与上述文献HKαα/-α4.2的病例有轻度贫血或MCV、MCH降低等临床特征不同，为首个临床表现及血液学各项指标均正常的HKαα/-α4.2病例。但因病例较罕见，病例数较少，因此该基因型对临床及血液学特征等的影响有待更多的病例进行研究。

综上，本研究首次发现HKαα/-α4.2患者无贫血症状，血液学检测正常，这与既往文献报道不同，这些发现有助于临床诊疗和遗传咨询。