PCL电纺纳米纤维膜的制备及其力学性能和生物相容性的研究*

高智华，赵劲民

（广西医科大学第一附属医院创伤骨科，南宁 530021）

静电纺丝分为普通电纺和熔融电纺，是一种简单而高效的制造工艺。其中普通电纺具有可控性强、操作简便的优点，制得的纳米纤维膜不仅直径小、纤维分布均匀，更重要的是比表面积大、孔隙率高，在组织工程、固定化酶催化、伤口敷料、超细滤膜和防护织物等领域得到广泛应用[1-2]。研究表明，静电纺丝纳米纤维的直径大小对细胞的黏附和增殖具有重要影响。在大尺寸、微米级尺寸和纳米级尺寸的纤维支架中，细胞分别主要分布在孔洞之中、单根纤维上以及多根纤维之间，不同直径大小的纤维对细胞生长具有促进作用。例如，微米级和纳米级纤维可以促进成骨细胞、成纤维细胞的增殖，而后者对平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等影响不大[3-4]。

聚己内酯（PCL）经由美国食品和药物管理局（FDA）批准认证，在组织工程领域中是最常用的高分子材料之一，具有良好的生物相容性和生物降解性。目前缺乏对不同浓度PCL 在不同纺丝电压和距离的条件下所制备的纳米纤维膜的性能对比研究。有文献报道，以材料浓度、纺丝电压、纺丝距离为参考变量对纳米纤维膜的形态结构、力学性能和生物活性作了较深研究[5-6]。通过改变纺丝电压和纺丝距离，制备出了不同浓度的PCL 纳米纤维膜，利用扫描电镜和力学仪器分析对比，探讨不同参数对静电纺丝膜的微观形态、直径大小和力学性能的影响；此外，将乳兔的骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养于电纺纳米纤维膜表面，观察细胞生长状况。本实验为PCL 纳米纤维膜在骨软骨缺损修复组织工程领域的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 出生3 d 的新西兰白兔1 只，购自广西医科大学实验动物中心。PCL 购自西格玛奥德里奇公司（中国上海）；六氟异丙醇购自麦克林公司（中国长沙）；α-低糖培养基（α-DMEM）购自Gibco 公司（美国）；胎牛血清购自VWR 公司（澳大利亚）；青－链霉素、胰蛋白酶和PBS 缓冲液均购自索莱宝公司（中国北京）；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自Dojindo 公司（日本）；Calcein-AM/PI染色试剂盒购自Invitrogen公司（美国）。

1.2 主要仪器 静电纺丝机购自能环新材料科技有限公司（中国苏州）；磁力搅拌器购自KEW-LAB公司（澳大利亚）；力学测试仪购自NSTRON 公司（美国）；电子精密天平购自TOLEDO 公司（瑞士）；全波长酶标仪购自Thermo Fisher公司（澳大利亚）；细胞恒温培养箱购自Thermo Fisher公司（美国）；超净工作台购自海尔公司（中国青岛）；倒置相差显微镜购自OLYMPUS 公司（日本）；扫描电子显微镜购自VEGA3LMU 公司（美国）；真空干燥箱购自龙伍机械有限公司（中国南京）；超声波清洗机购自新芝生物科技股份有限公司（中国宁波）。

1.3 纳米纤维膜的制备与分组 用电子精密天平准确称取不同重量的PCL 颗粒，溶于5 mL 六氟异丙醇溶液中，配制6%PCL、8%PCL、10%PCL 3 种不同浓度的纺丝前溶液，超声15 min 混匀，磁力搅拌器搅拌，超声30 min混匀。通过静电纺丝机制备出3 组纳米纤维膜，分别为6%PCL 组、8%PCL 组、10%PCL组。

研究不同纺丝电压时，选定8%PCL电纺溶液，将纺丝电压设置为5 kV、15 kV、25 kV，其他参数不变，制备3组纳米纤维膜，分别为8%PCL+5 kV组、8%PCL+15 kV组、8%PCL+25 kV组。

将纺丝距离设置为10 cm、15 cm和20 cm，其他参数不变，制备3 组纳米纤维膜，分别为8% PCL+10 cm组、8%PCL+15 cm组、8%PCL+20 cm组。

对照组为不放置任何纳米纤维膜。进行静电纺丝时，严格控制温度和湿度。将纳米纤维膜放置在真空干燥箱中干燥24 h后备用。

1.4 静电纺丝PCL 纳米纤维膜形态结构和机械性能的检测 将不同参数下获得的PCL 电纺纳米纤维膜裁剪为10 mm×10 mm的矩形，喷金后干燥2 h，置于扫描电镜（SEM）下观察其形态结构和直径，每个样本重复3 次，同一样本选择3 种不同倍数的视野进行观察。

打开力学测定仪，将每种电纺纳米纤维膜裁剪为20 mm×20 mm 的矩形，每个样本准备5 个待用。首先用游标卡尺测量膜的厚度并输入仪器电脑软件，设置初始距离为1 cm，拉伸速率为6 mm/min，调整好角度，测量拉伸应力、拉伸应变和杨氏模量。

1.5 兔BMSCs 的提取和培养 取出生3 d 的新西兰白兔，剃毛，注射3%戊巴比妥钠麻醉，浸泡在75%酒精中灭菌，在相对无菌条件下剪下乳兔的四肢，去除皮肤和部分肌肉，放在含5%青－链霉素的PBS缓冲液中，盖好培养皿，转移到超净台。用PBS 反复清洗，无菌纱布将肌肉组织剔除，同时剪去两端的软骨，最后利用注射器冲出骨髓。将含有BMSCs的培养皿置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，观察细胞形态，每3 d换1次培养液。待细胞长满后将其取出，转移到超净台中吸去培养液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化5 min，再加入2 mL 培养基终止消化。将细胞悬液转移到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞备用。

1.6 CCK-8 检测细胞活性 裁剪不同参数下制备的PCL电纺纳米纤维膜，轻轻放置在24 孔板中，上面放置铜环压住（已高压消毒）防止膜上浮，巴氏管吸取适量75%酒精到孔板中浸泡6 h，在通风的紫外灯橱下灭菌12 h。将兔BMSCs 以3×105的密度种于24 孔板中，3 d 后取出孔板，吸去培养液，PBS 清洗3次，避光加入25 μL CCK-8 和250 μL培养液，孵育2 h。用全波长酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度（OD）值。

1.7 活死细胞检测 将兔BMSCs 培养在不同参数下制备的纳米纤维膜上3 d，PBS清洗3次，按照Calcein-AM PI 活死细胞双染试剂盒说明书，避光加入活死细胞染色液，孵育25 min后吸去染色液。荧光显微镜下随机选择5 个视野，观察活细胞（呈绿色）的数量，拍照。用Image J 软件计算活细胞所占面积。活细胞所占面积=活细胞总数面积/拍照视野面积×100%。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纺丝材料浓度对纤维结构形态的影响 当PCL浓度为6%时，电镜下观察到纤维表面出现较多的串珠，纤维分布杂乱，当PCL 浓度为8%和10%时，串珠消失，纤维均匀分布，见图1。当纺丝电压为15 kV或纺丝距离为15 cm时，纳米纤维的直径最小，分布均匀，孔隙率较大，见图2、图3。

图1 不同材料浓度的PCL 电纺纳米纤维膜的SEM图

图2 不同施加电压的PCL 电纺纳米纤维膜的SEM图

图3 不同接收距离的PCL 电纺纳米纤维膜的SEM图

2.2 不同溶液浓度、施加电压和接收距离对纤维膜机械性能的影响 当浓度为变量时，与6%PCL 组和10%PCL 组比较，8%PCL 组的拉伸应力和杨氏模量提高；当纺丝电压为变量时，与8%PCL+5 kV组和8%PCL+25 kV组比较，8%PCL+15 kV组的拉伸应力和杨氏模量提高；当纺丝距离为变量时，与8% PCL+10 cm 组和8% PCL+20 cm 组比较，8%PCL+15 cm组的拉伸应力和杨氏模量提高，见图4。

图4 不同溶液浓度、施加电压和接收距离对纤维膜机械性能的影响

2.3 不同溶液浓度、施加电压和接收距离对负载兔BMSCs 纳米纤维膜细胞活性的影响 与对照组比较，8% PCL 组、8% PCL+15 kV 组、8% PCL+15 cm组细胞增殖活性和活细胞所占面积升高最明显（均P＜0.05）；不同浓度、不同施加电压和不同接收距离的PCL纳米纤维膜均可促进细胞黏附、生长且培养于膜上的细胞活性均优于对照组（均P＜0.05），见图5、图6。

图5 负载兔BMSCs的不同参数的PCL电纺纳米纤维膜的CCK-8检测结果

图6 负载兔BMSCs 的不同参数的PCL 电纺纳米纤维膜的活死细胞染色结果

3 讨论

本研究探讨了静电纺丝过程中不同工艺参数对PCL纳米纤维膜结构形态和细胞活性的影响，结果表明，不同的溶液浓度、纺丝电压、纺丝距离对纳米纤维膜的微观形态结构和力学性能以及生物相容性均有影响。

实验表明，当纺丝浓度较小时，纺丝前溶液的黏度也相对较小，致使聚合物分子链之间缠结机会较少，在纤维表面形成串珠。逐渐加大纺丝浓度可以改善纳米纤维的形态[7]。当浓度相同时，随着电压升高，纳米纤维膜的力学性能及细胞活性先升高后降低（P＜0.05）。这是因为，随着电压升高，电场强度也随之升高，对喷射出的溶液牵拉作用增强，导致纳米纤维直径减小，此时，纳米纤维膜的孔隙率较高，更有利于细胞生长，同时，纳米纤维之间接触点增多，提高了纤维膜的力学性能[8]。当电压强度过高时，射流迅速到达接收板上，没有得到充分地牵拉，此时，纤维直径增大，纤维膜的力学性能和生物活性均下降[9-10]。在同一浓度下，随着纺丝距离的增加，纳米纤维膜的机械性能及细胞活性先升高后降低（P＜0.05）。这是因为当纺丝距离较小时，电场强度较大，对喷射出的溶液牵拉作用较强，当作用时间较短，因牵拉不充分导致纤维直径较大；随着纺丝距离增加，电场强度略微减小，同时牵拉作用时间延长，此时射流牵拉充分因而纤维直径减小，纳米纤维膜的孔隙率较高，更有利于细胞生长，同时，纳米纤维之间接触点增多，提高了纤维膜的力学性能。当接收距离过大时，电场强度微弱，即使有较长的作用时间，射流也无法得到充分地牵拉，导致纤维直径增大，纤维膜的力学性能和生物活性均下降[11]。

综上所述，不同的纺丝浓度、纺丝电压、纺丝距离可以改变PCL纳米纤维膜的微观结构、力学性能和生物相容性。