鼻咽癌细胞条件培养基诱导THP-1源巨噬细胞向M2型极化*

姚小暄，杨雨嘉，霍慧敏，江 川，崔 昆，黄中恒，唐锦平，韦正波△，谢 莹,3△

（1.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021；2.广西医科大学生命科学研究院，南宁 530021；3.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁 530021）

鼻咽癌是一种与Epstein-Barr 病毒感染密切相关的头颈部常见恶性肿瘤，具有独特的地区分布，在东亚、东南亚、北非和东非，特别是中国南方等地区明显高发[1]。从鼻咽癌的组织学检测及单细胞测序中发现，癌细胞周围有大量免疫细胞浸润，提示免疫失调在鼻咽癌的发生、发展过程中发挥重要的作用[2-4]。肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），来源于腹腔巨噬细胞、表皮朗格汉斯细胞、卵黄囊前体、骨髓造血干细胞等，在微环境中各种信号因子的调节下极化成不同表型的巨噬细胞，通常分为经典活化型（M1-TAM）和交替活化型（M2-TAM）两种功能亚型[5]。分泌至肿瘤微环境中的干扰素（IFN）-γ、脂多糖（LPS）以及粒细胞集落刺激因子（M-CSF）等，通过不同途径激活巨噬细胞向M1-TAM型极化。M1型细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-12、IL-6 和IL-1β等促炎因子，并将肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞，启动CD4+Th1依赖的免疫反应杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的侵袭、转移，促进机体的免疫应答[6-7]。而肿瘤微环境中，CD4+T细胞分泌的IL-4、调节性T细胞分泌的IL-10、Th2 型细胞分泌的IL-13 以及B 细胞分泌的免疫球蛋白等，使招募的巨噬细胞向M2-TAM型极化[8]。M2-TAM分泌转化生长因子（TGF）-β1、IL-10、血管内皮生长因子（VEGF）、活性氧类（ROS）、前列腺素E2（PGE2）、趋化因子配体18（CCL-18）等，形成免疫抑制微环境，诱导新生血管和淋巴管形成，促进肿瘤侵袭、转移[9]。本研究拟探索基于人单核细胞白血病THP-1 细胞的体外巨噬细胞极化模型，同时探讨鼻咽癌细胞系（5-8F、HONE1）培养上清液对THP-1来源巨噬细胞极化方向的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 人THP-1细胞（Procell CL-0233）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人鼻咽癌低分化鳞状细胞株5-8F和HONE1购于湖南湘雅中心实验室细胞库，由本实验室保存。

1.2 主要试剂 RPMI-1640培养基、DMEM完全培养基购于美国Gibco 公司；流式抗体PerCP-Cyanine5.5 anti-Human CD14、FITC anti-Human CD68、PE anti-Human CD86、Alexa Fluor 647 anti-Human CD163、APC anti-Human CD206 均购自美国Thermo Fisher 公司；引物由AuGCT DNA-SYN Biotechnology Synthesis Lab 提供；佛波酯（PMA）和LPS 购于Sigma-Aldrich 公司；重组人IL-13、IL-4、IFN-γ 均购于PeproTech公司。

1.3 THP-1-M0 巨噬细胞分化 将THP-1 细胞按1×106～2×106个/mL 密度接种于完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3 d 换液。分别用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA 刺激THP-1 细胞48 h，诱导转化为M0型巨噬细胞，每组设置3个复孔，倒置相差显微镜下观察THP-1细胞形态，筛选PMA的最佳刺激浓度。

1.4 细胞因子诱导THP-1-M0 向M1 型和M2 型极化 PMA刺激后，用RPMI-1640完全培养基培养细胞24 h，加入10 pg/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ 处理72 h，使M0 向类M1 型细胞方向极化，得到THP-1-M1；加 入20 ng/mL IL-4 和20 ng/mL IL-13处理THP-1-M0 使其向类M2 型方向极化，得到THP-1-M2。

1.5 鼻咽癌细胞条件培养基对THP-1源M0型巨噬细胞极化的影响 取对数生长期的鼻咽癌细胞5-8F 和HONE1 以适当密度接种于T25 细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后，换新鲜的完全培养基继续培养48 h，细胞汇合度达到80%时收集培养上清液，用0.22 μm 孔径的细胞滤器过滤细胞碎片，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，取上清。按1∶1 体积比加入新鲜完全培养基，分别配置5-8F 和HONE1 细胞的条件培养基，加入THP-1 源M0 细胞中，处理48 h，以不作处理的M0 细胞作为阴性对照组，实验组为5-8F-M0及HONE1-M0。用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测多个标记物表达，分析THP-1来源的巨噬细胞极化方向。

1.6 流式细胞术检测巨噬细胞CD14、CD68、CD86、CD163、CD206表达 胞外流式抗体的检测：PBS冲洗，消化细胞，25 ℃、1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用细胞染色缓冲液重悬细胞，制成终浓度为1×106～10×106个/mL 的细胞悬液，加入抗体，室温避光孵育30 min，染色缓冲液洗涤、重悬细胞，过滤后上机检测。

胞内流式抗体的检测：制备单细胞悬液后，固定液和破膜缓冲液固定细胞破膜30～90 min，破膜液洗涤，加入蛋白抗体，室温避光孵育30 min，破膜液洗涤，细胞染色缓冲液重悬，过滤细胞后上机，分别检测CD14、CD68、CD86、CD163和CD206阳性细胞比例。

1.7 RT-qPCR法检测IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α表达 用Trizol 裂解细胞，提取细胞总RNA，Nanodrop分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，用QuantStudioTM6 Real time-PCR 仪进行PCR 扩增，采用2-ΔΔCT法计算IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.8 统计学方法 用GraphPad Prism 8软件统计数据及作图，计量资料以均数±标准差（）表示，经方差齐性检验后，若满员方差齐，则两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。流式数据采用FlowJo_V10分析。

2 结果

2.1 PMA 浓度对THP-1 细胞贴壁情况和细胞形态的影响 用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA刺激THP-1细胞后，多数呈圆形透亮、大小均一的悬浮细胞，逐渐贴壁，细胞形态近似分为3 种：长梭形且突起明显的细胞、中心稍暗的近圆形细胞、不规则多触角形细胞；100 nmol/L PMA 刺激的已贴壁THP-1细胞的形态变化明显，细胞体积增大，部分细胞伸出多个伪足和突起，核碎裂、核空泡细胞数目少于200 nmol/L 组，见图1。因此，后续实验选择100 nmol/L作为PMA的最佳刺激浓度。

图1 THP-1细胞形态图

2.2 巨噬细胞相关标记物的表达 与THP-1 组比较，THP-1-M0 组CD68、CD86 表达升高（均P＜0.05），THP-1-M1 组CD68、CD86、CD163 表达升高（均P＜0.05），THP-1-M2 组CD14 表达降低（P＜0.05），CD68、CD86、CD163 和CD206 表达升高（均P＜0.05），见图2、表2。

表2 巨噬细胞表面标记物的表达情况，n=3

表2 巨噬细胞表面标记物的表达情况，n=3

与THP-1组比较，*P＜0.05。

图2 CD14、CD68、CD86、CD163和CD206在不同巨噬细胞亚型中的表达

2.3 M1 型和M2 型巨噬细胞标志基因的表达 与THP-1 组比较，THP-1-M0 组IL-10、TGF-β1表达上调（均P＜0.05），THP-1-M1 组IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1表达上调（均P＜0.05），THP-1-M2组IL-10、TGF-β1表达上调（均P＜0.05），见表3。

表3 M1型和M2型巨噬细胞标志基因的表达，n=3

表3 M1型和M2型巨噬细胞标志基因的表达，n=3

与THP-1组比较，*P＜0.05。

2.4 鼻咽癌细胞条件培养基对THP-1源M0细胞极化方向的影响 与M0 组比较，5-8F-M0 组、HONE1-M0组TNF-α、TGF-β1表达降低，IL-10表达升高，HONE1-M0组IL-6表达升高（均P＜0.05），见表4。

表4 鼻咽癌细胞条件培养基处理后的THP-1-M0基因表达水平，n=3

表4 鼻咽癌细胞条件培养基处理后的THP-1-M0基因表达水平，n=3

与M0组比较，*P＜0.05。

3 讨论

巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中起着重要的作用，但人源巨噬细胞多用作体外的原代培养，难以长期生存、大量传代。因此，体外建立活化的巨噬细胞模型对于巨噬细胞各亚型的功能研究有重要意义。人源THP-1 细胞系作为体外巨噬细胞诱导模型之一，常用来研究炎症相关巨噬细胞亚型的功能，THP-1 细胞在形态学和分化特征上与原代巨噬细胞相似，低密度的PMA 即可诱导其贴壁分化[10]。以THP-1 细胞作为研究单核巨噬细胞极化模型的另一优势为，THP-1细胞遗传同质性高，可在体外传代培养几十代的同时维持细胞活力，细胞间的变异程度低[11]。本课题组采用THP-1细胞来源的巨噬细胞体外诱导模型，是诱导巨噬细胞极化的良好模型。

巨噬细胞被招募到肿瘤微环境后，具有极强的异质性和可塑性，其免疫学特征常根据微环境中释放的细胞因子而改变[12]。TAMs 主要分为M1 型和M2 型，当组织或器官受到病原体感染时，M1 型巨噬细胞介导Th1型免疫反应，释放TNF-α、IL-1β、IL-12等促炎因子，激活T细胞，产生Th1型细胞毒性反应，还可在LPS 和IFN-γ 的刺激下高表达CD68、CD86等共刺激分子，并产生IL-6等MHCⅡ类分子，参与炎症反应和外来病原体的清除，抑制肿瘤的进展。另一种类型为粒细胞或Th2 型细胞分泌的IL-4、IL-13 刺激而成的CD163+、CD206+M2 型巨噬细胞，高表达IL-10、TGF-β、VEGF、MMP9、TGFB1 和PLA2G7等细胞因子，抑制炎症的进展，促进组织修复、重塑血管生成[13-16]。本课题组构建的体外巨噬细胞模型采用相对特异性标记物CD163、CD206 对THP-1-M2进行标记，两种表面蛋白在IL-4和IL-13的作用下均升高；另一方面，THP-1-M0组中单核巨噬细胞标记蛋白CD68、CD86 表达量在加入LPS 和IFN-γ孵育后均升高，表明成功将M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。

在探讨鼻咽癌细胞条件培养基对巨噬细胞极化方向的影响时，以本课题组建立的巨噬细胞体外模型为基础，向THP-1-M0 组中分别加入5-8F 条件培养基和HONE1条件培养基，结果显示，5-8F条件培养基诱导的M0 型巨噬细胞，促炎基因TNF-α表达下调，抑炎基因IL-10上调，表明5-8F条件培养基主要刺激M0 型巨噬细胞向M2 表型极化；而HONE1细胞条件培养基诱导M0细胞后IL-6、IL-10同时升高，提示可刺激部分M1 型巨噬细胞产生。5-8F-M0 和HONE1-M0 这两组中TGF-β1表达均降低，可能是因为TGF-β家族主要介导肿瘤细胞的免疫抑制功能，当加入肿瘤细胞条件培养基后，巨噬细胞各亚型的免疫功能均受到限制。基于两种鼻咽癌细胞条件培养基诱导M0 极化方向的差异结果，本课题组考虑可能与细胞的生物学特性相关。5-8F细胞是从SUNE-1鼻咽癌细胞株体外优化筛选出的具有高淋巴结转移潜能的鼻咽癌低分化鳞状细胞癌亚株，高淋巴结转移潜能是否与其对周围环境中巨噬细胞的M2 型极化作用相关，有待于进一步研究。