基于转录组测序分析并验证胫骨横向骨搬移术治疗糖尿病足患者外周血的miRNA*

苏宏杰，花奇凯,Δ

（1.广西医科大学第一附属医院骨关节外科，南宁 530021；2.广西壮族自治区糖尿病足保肢工程研究中心，南宁 530021；3.广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，南宁 530021；4.广西医科大学再生医学研究中心，南宁 530021）

全球每年糖尿病足的患病率约为6.3%[1]。糖尿病足溃疡是糖尿病微血管病变与神经病变的并发症之一，其治疗周期长，患者治疗花费巨大。而及时有效的治疗对于避免截肢至关重要。糖尿病造成的高血糖环境是内皮损伤的重要诱因。由于糖基化产物的堆积，氧化应激损伤和巨噬细胞的M2极化障碍等导致的长期慢性炎症，从而造成糖尿病性伤口不愈合[2]。在一项回顾性分析当中，糖尿病足患者经过胫骨横向骨搬移术（tibial transverse transport，TTT）治疗，其足溃疡治愈率达96%，而在术后3 个月仍然发现足底有较高的血流灌注，初步证明了该方案治疗糖尿病足的有效性[3]。

MicroRNA（miRNA）通过结合到靶基因的3’UTR 或者CDS 区域，调节对应基因表达与翻译，从而影响愈合的各个环节，如调节局部炎症反应、坏死组织清除、微血管新生、成纤维细胞增殖等[4]。牵张成骨过程中伴随着对机械敏感的miRNA变化，这些miRNA在调节组织修复、血管发生和细胞增殖方面具有积极作用[5]，而TTT 本质上也是牵张成骨的一种过程。Nie 等[6]经TTT 治疗发现血管的增生和缺损组织的修复。由此本课题组推测，在完成搬移调节周期后，由于近端的骨搬移作用，激发了远端足部组织修复的潜能，创造了一个愈合的良好局面。目前糖尿病足患者的骨搬移治疗中外周血的miRNA表达变化情况鲜少报道，而转录组测序可快速获取特定状态下组织或器官的大部分转录本序列信息。为此，本课题组拟对经TTT治疗糖尿病足患者的外周血进行转录组测序并分析，探究治疗促进糖尿病足创面愈合可能的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年12 月至2021 年6 月在广西医科大学第一附属医院骨关节外科接受住院治疗的糖尿病足患者。病例纳入标准：（1）临床诊断为2型糖尿病，合并糖尿病足溃疡；（2）愿意参与本项研究并同意治疗方案。排除标准：（1）患有心脑、肝脏、肾脏等重要脏器疾病；（2）患有恶性肿瘤疾病；（3）患有自身免疫疾病；（4）患有低蛋白血症（白蛋白＜30 g/L）或贫血（血红蛋白＜90 g/L）；（5）患有凝血障碍或其他采血禁忌证者。收集33 例糖尿病足患者的全血样本进行研究。其中3 例患者经TTT 治疗共计6份全血样本用于转录组测序，分为TTT术前组3份和TTT术后组3份；另30例血样本用于实时定量荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证，分为对照治疗组和TTT 组，每组15 例，对照治疗组仅接受清创和清洁换药的治疗，TTT 组为接受TTT 手术治疗。两组患者年龄、性别、体质指数、随机血糖、甘油三脂、总胆固醇、Wagner分级等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性，见表1。术后对30 例经过RT-qPCR 验证的患者进行随访调查愈合情况。本研究遵守赫尔辛基宣言有关的伦理要求，已经获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（No.2021KY-E-305）。已告知受试患者本研究内容，并签署知情同意书。

表1 糖尿病足患者临床基本信息

1.2 TTT治疗方案

在胫骨中上端1/3处，用截骨器截取5.0 cm×1.5 cm的长方形骨块后置入TTT外固定装置，下肢创面行清创治疗处理。TTT 外固定装置调节方法为调节螺母使骨块发生上抬或下降，每天移动距离为1 mm。调节周期为连续上抬14 d，再下降复位14 d。调节周期结束之后拆除外固定装置。术后每日进行伤口清洁换药[7]。

1.3 高通量测序

取样时间为手术前一天和术后30 d。用PAXgene Blood RNA tube采血管（美国BD公司）收集保存外周全血。每份样本采集约2.5 mL静脉血，采血管中包含7.5 mL RNA 保存液。采集完毕上下颠倒混匀，转移至－80 ℃冻存，用于外周血RNA 测序。主要步骤大致包括对血样本进行总RNA的提取，转录组文库的制备，上机测序以及原始数据的处理。测序的原始数据已经上传至公共数据库SRA（Sequence Read Archive）（数据编号：BioProject:PRJNA807833）。

1.4 生物信息学分析

1.4.1 差异表达分析 当差异倍数（Flod Change）大于2，即|log2FC|＞1 且P＜0.05 时被认为是差异显著的基因。

1.4.2 功能富集分析 利用Cluster Profiler 软件（v3.5.1）进行GO 生物学过程（Gene Ontology Biological Process）的注释和京都基因和基因组通路（KEGG pathway）富集分析，推测所预测的靶基因的生物学功能。

1.4.3 蛋白—蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析 利用在线数据库STRING（https://string-db.org/，v 11.5，2021-12-01）对预测靶基因进行PPI网络分析。

1.4.4 核心基因预测 利用CytoHubba 插件利用MNC算法计算节点评分高的基因，认定为核心基因（Hub-Gene），即存在高度的节点中心性。

1.5 临床样本RT-qPCR验证

选择差异表达显著的miRNA 进行RT-qPCR 验证，用PAXgene Blood miRNA Kit（武汉君诺德Cat.2145A）进行总RNA 提取，用miRNA cDNA 试剂盒（武汉君诺德Cat.4205）进行反转录。用FS384 real-time PCR system 型荧光定量PCR 仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。hsa-miR-103a-3p 引物序列如下，上游：5’-GCAGAGCAGCATTGTACAG-3’，下游：5’-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCATAG-3’；U6内参引物序列为：上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布时结果以均数±标准差表示（），组间比较用t检验；偏态分布以中位数（四分位距）[M（Qr）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。计数资料采用n（%）表示，率的比较采用卡方检验或Fisher 精确检验。利用R 软件（v3.6.1）中的DEseq2 包（v 1.20.0）进行差异表达分析。利用R 软件中的ggplot2包（v3.3.0）对分析结果进行可视化分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA的差异表达情况

统计获得差异表达的miRNA 共计89 个（log2|Foldchange|＞1，P＜0.05），展示了其中差异表达排名前10 的上调和下调的miRNA 统计（表2）。聚类分析和火山图展示了TTT 术前组与TTT 术后组（完成装置调节周期，并已拆除外固定装置）外周血中miRNA差异表达情况（图1A、图1B）。综合差异倍数以及差异显著性，选取了hsa-miR-103a-3p进行研究。靶基因预测选用了miRDB（http://mirdb.org/，2021-12），Targetscan（https://www.targetscan.org/v7.0，2021-12），miRTarbase（https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/，2021-12）3 个miRNA 数据库进行分析，最后取交集获得了靶基因数目为109个（图1C）。

图1 miRNA的差异表达分析

表2 差异表达显著上调和下调的排名前5的miRNA

2.2 KEGG通路和GO生物学过程富集

通过Cluster Profiler 软件对这109 个基因进行GO 生物学过程分析和KEGG pathway分析，KEGG通路分析结果提示主要与AMPK信号通路相关，见图2A。GO生物学过程主要与发芽血管生成的调控（GO：1903670）、发芽血管生成的正调控（GO：1903672）、大分子代谢过程负调控（GO：0010605）和细胞蛋白修饰过程（GO：0006464）相关，见图2B。

图2 KEGG通路和GO生物学过程富集分析

2.3 PPI网络构建和核心基因筛选

生物的PPI反映了调节细胞的各种蛋白之间的交互关系，构建这类网络可提高对基因功能和细胞对不同信号的反应行为的预测。通过STRING数据库获得了这109 个靶基因的共表达网络关系，见图3A。通过对以上109 个靶基因进行MNC 算法得出排名前10 的节点为AGO1、CDK6、TNRC6B、DICER1、CAPZA2、KIF23、KIF5A、MTMR3、MTMR4、PIK3R1等。其中AGO1、PIK3R1与细胞增殖和血管生成相关，可能是hsa-miR-103a-3p发挥促血管生成作用的效应靶点，见图3B。

图3 PPI网络构建和核心基因筛选

2.4 临床样本验证和随访

在患者治疗结束的第6 个月时进行随访，TTT组愈合效果良好，总计获得随访15 例，其中完全愈合11例，延迟愈合4例。对照治疗组获得随访15例，其中完全愈合5 例，延迟愈合10 例。对hsa-miR-103a-3p进行验证，TTT组的外周全血中的hsa-miR-103a-3p 的相对表达量高于对照治疗组3.7 倍（P＜0.001），见图4。

图4 对照治疗组和TTT 组的外周全血中hsa-miR-103a-3p的相对表达量

3 讨论

TTT 是一种运用Ilizarov 张力—应力法则的技术[8]，通过类似手风琴的方式搬移骨块，促进了局部的血液循环。在国内最早由曲龙教授用于进行下肢血栓闭塞性脉管炎的治疗[9]，经过花奇凯团队的改良率先运用于糖尿病足创面治疗[10]。在2020 年累计治疗516例糖尿病足，取得优秀的治疗成果[11]，而且在非糖尿病足溃疡治疗当中也取得较好疗效[6]。本研究中的15 例患者接受TTT 治疗，术后经过简单的生理盐水清洁换药，愈合情况良好。在临床治疗当中发现一侧肢体的TTT 治疗可以促进双侧足溃疡的愈合，由此推测到TTT的作用可能为一种全身性的效应。于是本研究从外周循环的角度出发，进行外周血的转录组测序，发现hsa-miR-103a-3p 表达在治疗后发生明显改变。这表明该miRNA可能对促进伤口愈合具有有利影响。

近年来研究表明miR-103a对细胞代谢、增殖与血管生成过程起到促进作用。在干细胞的代谢过程中，miR-103/miR-107 家族靶向相关蛋白促进干细胞的增殖能力，并维持角膜干细胞的干性和促进细胞黏附[12]。在缺氧条件下，高水平miR-103a促进了结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解[13]。在肝细胞癌中，通过PKCα 活性来增加端粒酶活性促进肝细胞癌细胞HCC 的增殖[14]。在缺氧条件下miR-103作为缺氧反应原件靶向AGO1促进了血管生成[15]。TTT 在胫骨近端的作用，本质上也创造了一个特殊的缺氧的微环境。结合上述研究报道，本研究笔者推测在缺氧的环境下，hsa-miR-103a-3p 表达升高可能对远端伤口愈合起到有益作用。

综上，本研究通过外周血转录组测序并分析发现经TTT 治疗的外周血hsa-miR-103a-3p 表达较治疗前上调，并通过另一组独立临床样本RT-qPCR验证TTT 治疗组hsa-miR-103a-3p 相对表达量较对照治疗组上调。由此推测hsa-miR-103a-3p 可能为TTT治疗的效应miRNA之一，这为进一步探究其伤口愈合机制提供了实验基础。