基于NLRP3研究β-胡萝卜素对大鼠心肌纤维化的作用机制*

范奕好，葛晨亮，程 阳，何 燕

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是多种心脏疾病如缺血性心肌病等的重要病理变化，导致正常组织结构的破坏和心脏进行性功能障碍[1-3]。药物是比较便捷的治疗方式，多项研究发现钙通道阻滞剂、β-肾上腺素受体阻滞剂等在调节重塑过程和减少不良心血管事件的发生方面有效[4]。然而这些药物不能完全抑制MF 发展，因此开发新型的更有效且平价的药物仍十分重要。植物中的部分材料花青素、维生素C和类胡萝卜素等，具有重要的抗氧化以及缓解炎症的作用[5]。β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，作为维生素A的前体对健康有益并能降低某些疾病风险[6-7]。它有效减少了促炎细胞因子的生成，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）等炎症标志物[8-10]。含核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（Pyrin Domain Containing Protein 3，NLRP3）与炎症疾病的启动和进展密切相关，能够作为一个有效的治疗靶点[11-12]。它由多种病原体和相关信号激活，能使NLRP3、ASC 和procaspase 1 组成的细胞质复合物形成，激活caspase-1，促炎细胞因子IL-1β 和IL-18 的水解成熟[13-15]。因此，本研究旨在与探索β-胡萝卜素能否通过抑制NLRP3 来缓解MF，为MF 的治疗提供新的药物治疗方向。

1 材料方法

1.1 实验动物 所有动物实验程序均符合国家卫生研究院（NIH）现行指南，并获得广西医科大学伦理委员会批准。选用长沙天勤公司成年雄性SD大鼠18只，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，使用许可证编号：SYXK 桂2014-0002，年龄6～8 周龄，体重280～320 g。在25 ℃、12 h 的光暗周期下，大鼠能够自由获取水和食物，所有动物实验均在广西医科大学实验动物中心进行。

1.2 实验药物及相关试剂 β-胡萝卜素购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（货号：C110501-5 g），异丙肾上腺素购于大连美仑生物技术有限公司（货号：MB5204），二甲基亚砜（DMSO）购于北京索莱宝有限公司（货号：CAS＃67-68-5），鼠抗NLRP3抗体购于北京博奥森生物技术有限公司（货号bs-10021R，稀释1∶2 000），鼠抗GAPDH抗体购于Proteintech抗体公司（货号：60004-1-Ig，稀释1∶5 000），鼠抗caspase-1购于Abmart抗体公司（货号：P29466，稀释1∶1 000）Ⅰ型胶原多克隆抗体购于Proteintech抗体公司（货号：14695，稀释1:200）、Ⅲ型胶原多克隆抗体购于Proteintech 抗体公司（货号22734，稀释1∶1 000）、兔抗IL-1β抗体购于北京博奥森生物技术有限公司（货号：bs-0812R，稀释1∶400）、兔抗IL-18抗体购于北京博奥森生物技术有限公司（货号：bs-0529R，稀释1∶400），二抗购于Servicebio 抗体公司（货号：GB233303，稀释1∶200）。

1.3 实验分组及处理 18 只SD 大鼠在适应1 周后，随机分成对照组、模型组及β-胡萝卜素组，每组6 只。对照组皮下注射生理盐水（5 mg/kg）及灌胃1 mL二甲基亚砜（DMSO）；模型组仅皮下注射异丙肾上腺素（ISO）（5 mg/kg）及灌胃1 mL DMSO，β-胡萝卜素组皮下注射ISO（5 mg/kg）及灌胃β-胡萝卜素（30 mg/kg,1 mL DMSO 溶解）[13]。大鼠MF 模型的建立：采用皮下注射ISO，每日5 mg/kg，皮下注射均为下午，且连续10 d[16]。第11天，对大鼠使用过量戊巴比妥（150 mg/kg）深度麻醉后处死，取出心脏称重，剪取部分左心室心脏组织为Western blotting 实验做准备，余下放入4%组织固定液中固定作切片。

1.4 免疫印迹实验（Western blotting）检测NLRP3、caspase-1、caspase-1-p20 相对表达量 将大鼠心脏组织从-80 ℃冰箱取出，加入RIPA 裂解液，用低温组织研磨机在4 ℃、60 Hz 下作用50 s 提取总蛋白。使用BCA 蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度。使用SDS-PAGE电泳与湿转法转膜，在5%浓度的脱脂牛奶中封闭后清洗，加入NLRP3、caspase-1 抗体，4 ℃冰箱孵育过夜。再经过二抗孵育显影。

1.5 大鼠心肌组织的心脏指数检测 在麻醉后处死大鼠前测量每只动物的体重，将心脏取出吸干心脏组织表面水分再后测量其心脏重量，通过将心脏重量（mg）除以体重（g）来评估心脏指数。

1.6 大鼠心脏Masson 染色 心室组织收集于4%甲醛溶液中，石蜡包埋，切片为5 μm，并使用Masson三色染色。在光学显微镜下观察染色切片，每个切片随机选择3个区域，以检查组织学外观和与MF相关的变化。

1.7 大鼠心肌组织的免疫组化分析Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen Ⅲ）、IL-1β、IL-18 表达量 心脏组织在二甲苯和系列乙醇稀释液中再水化，并在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。然后将切片分别加入Ⅰ型胶原多克隆抗体、Ⅲ型胶原多克隆抗体、兔抗IL-1β 抗体、兔抗IL-18 抗体在4 ℃下孵育过夜。羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗组织，用二氨基联苯胺染色，并在光学显微镜下观察。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0中进行数据统计分析。所有计数资料数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-胡萝卜素对心脏指数的影响 与对照组比较，在模型组心脏指数较高（P＜0.05），说明模型建成后心脏发生MF 使心脏肥厚；β-胡萝卜素组心脏指数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠心脏指数比较

表1 各组大鼠心脏指数比较

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

2.2 β-胡萝卜素对大鼠MF范围的影响 观察大鼠心脏样本Masson 染色显示MF 范围主要在心肌内膜，模型组的MF 程度显著，说明建模成功，β-胡萝卜素组MF程度明显减少，见图1。

图1 大鼠心脏组织肉眼观及Masson染色结果

2.3 β-胡萝卜素能够降低MF 大鼠NLRP3 和caspase-1-p20 的表达 与对照组比较，模型组NLRP3和caspase-1-p20的蛋白表达量增加（均P＜0.05）；与模型组比较，β-胡萝卜素组NLRP3 和caspase-1-p20的蛋白表达量降低（P＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠心肌组织中NLRP3、procaspase-1、caspase-1-p20的表达情况

2.4 β-胡萝卜素对大鼠MF 中IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ因子的影响 与对照组比较，模型组大鼠的IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达量升高（均P＜0.05）；与模型组比较，β-胡萝卜素组大鼠的IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ蛋白表达量降低（均P＜0.05），见图3、图4。

图3 大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18的免疫组化结果

图4 各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的免疫组化结果

3 讨论

炎性疾病中，NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物，由一个受体、一个接头蛋白和procaspase-1 组成，诱导IL-1β、IL-18 成熟并分泌[17]。许多研究发现，一些NLRP3抑制剂能够有效减少炎症的发生发展。在心肌梗死引起强烈炎症，IL-1β 和IL-18 是此反应的关键因素，MCC950 选择性抑制NLRP3，减少剪切体的形成，抑制IL-1β、IL-18 的成熟，减少心肌梗死及纤维化范围[18]。MF常与NLRP3的过量表达息息相关。如糖尿病型心肌病中MF是其主要心脏病理变化之一，Wang等[19]研究者发现杂色云芝能够抑制NLRP3 的表达，可使caspase-1、IL-1β 以及IL-18分泌减少，从而降低MF的程度。

β-胡萝卜素作为类或萝卜素的一种，被证实能够抑制炎症反应和炎症因子。如Rodríguez 等[20]研究中发现，缺乏β-胡萝卜素的儿童体内炎症因子IL-6的水平高于正常摄入β-胡萝卜素的儿童。痛风性关节炎的研究中发现，β-胡萝卜素与NLRP3-PYD的直接结合干扰了NLRP3-PYD 和ASC-PYD 之间的相互作用，从而抑制痛风晶石诱导的NLRP3炎症小体的激活，减少了膝关节组织随后的炎症症状[13]。

为探索β-胡萝卜素在MF 中是否存在相似作用，本实验中采用了与痛风性关节炎研究中相同的β-胡萝卜素的剂量30 mg/kg对MF模型的大鼠进行灌胃治疗，从Masson染色的结果来看模型组因ISO作用心肌细胞排列混乱，细胞间质纤维蛋白增加，而经β-胡萝卜素治疗后，心肌细胞排列紧密有序，细胞间质纤维蛋白减少，且免疫组化结果显示β-胡萝卜素组中MF 的主要标志物纤维蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达量相较于模型组减少（均P＜0.05）。针对NLRP3 进行Western blotting 发现NLRP3 在模型组中表达量增加（均P＜0.05），表明MF与NLRP3表达增加有关，而β-胡萝卜素治疗后其表达量下降，并且caspase-1-p20 的表达量也有下降（均P＜0.05）。有研究表明，NLRP3 与caspase-1 结合产生caspase-1-p20，即NLRP3 表达增加将使caspase-1-p20表达增加，作为一种剪切体caspase-1-p20能够将前体IL-18 及前体IL-1β 剪切为成熟体,激活后的IL-1β、IL-18则释放到细胞外，引起组织细胞的炎症反应[21]。免疫组化结果则发现β-胡萝卜素组细胞间炎症介质IL-1β、IL-18的表达量低于模型组（均P＜0.05），说明β-胡萝卜素可能通过减少NLRP3继而抑制剪切体caspase-1-p20的表达从而减少IL-18、IL-1β的表达。

综上所述，β-胡萝卜素可减少心肌组织中NLRP3 的表达进而减少细胞间质中炎症指标IL-1β、IL-18 以及胶原纤维指标Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达延缓MF的发展。但研究尚未能探索到更深入的分子结构机制，仍有待进一步研究，期望为MF的治疗提供新药物治疗方向。