结直肠癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9的表达变化观察

白岩，徐杰，运涛

1 天津市第五中心医院普外一科，天津 300450；2 天津市第五中心医院普外科

结直肠癌又名大肠癌，是指大肠上皮来源的癌症，包括结肠癌与直肠癌，在我国以直肠癌最为常见［1］。流行病学显示，全球范围内结直肠癌发病率、病死率均位居全部恶性肿瘤中第5 位，且好发于中老年群体。结直肠癌发生、进展过程复杂多变，其发病机制尚未完全探明［2］。研究显示，多种基因/蛋白质参与了结直肠癌的发生、进展、侵袭、转移等一系列生物学行为的调控［3］。卷曲螺旋结构域（CCDC）基因家族中的一些基因被证实与恶性肿瘤有关，CCDC12作为CCDC 家族一员，有研究发现其和结直肠癌有关［4］。转录因子叉头框（FOX）家族是调控肿瘤侵袭、转移的重要家族，其中的FOXO3a 在多种恶性肿瘤组织中呈低表达［5］。Twist为碱性螺旋—环螺旋家族中一员，是调控肿瘤细胞凋亡的重要基因之一［6］。MMP-9 为 FOXO3a 调控的众多下游蛋白之一，和肿瘤侵袭、转移相关［7］。目前，关于结直肠癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist 表达水平的报道较多，但 CCDC12、FOXO3a、Twist 表达与 MMP-9 表达相关性报道较少。本研究观察了结直肠癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 的表达变化，同时探讨上述四指标与结直肠癌患者临床病理参数间的关系以及四指标之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017 年 1 月~2020 年 1 月天津市第五中心医院收治的老年结直肠癌患者82例，其中男54 例、女 28 例，年龄 65~85（75.62 ± 8.57）岁，体质量指数（BMI）为（20.66 ± 2.64）kg/m2。纳入标准：①经术后病理检查确诊为结直肠癌患者；②年龄≥65 岁；③临床资料完整；④术前未行放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗等；⑤患者家属知情同意。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②年龄＜65 岁患者；③临床资料不完整患者；④合并严重心、肝、肾等脏器功能障碍患者；⑤合并血液系统疾病患者；⑥合并免疫系统疾病患者。

1.2 结直肠组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白的检测 采用免疫组化SP 法。82 例患者均接受结直肠癌根治术，术后留存切除的新鲜（离体30 min 内）结直肠癌组织（癌灶中心处）及癌旁正常肠黏膜组织（距肿瘤组织8~10 cm 处）标本，置入EP管内，液氮冻存置于-80 ℃冷存待检。取组织石蜡包块，常规切片（除Twist蛋白为3 μm外，其余3种蛋白均为4 μm）、脱蜡处理、高压修复抗原、阻断灭活内源性过氧化物酶、滴加羊血清封闭、滴加采用磷酸缓冲盐溶液（PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司）稀释至1∶500 兔抗人CCDC12 一抗（英国Eter-Life）/1∶150 兔抗人 FOXO3a 一抗（德国 Novus）/1∶200 兔抗人 Twist 一抗（美国 Santa Cruz）/1∶150 兔抗人MMP-9 一抗（美国Cell Signaling Technology），PBS 冲洗，滴加经辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，滴加链霉素抗生素蛋白—过氧化物酶（SP，北京中杉金桥生物技术有限公司），二氨基联苯胺（DAB，北京中杉金桥生物技术有限公司）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片、镜检。设置PBS代替一抗为阴性对照。由两位资深病理医师双盲法单独阅片，×400倍光学显微镜下随取抽取5个视野，每个视野选择100 个细胞，根据阳性细胞占比和染色强度的乘积判定CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达情况。阳性细胞占比：无计0分，1%~25%计1分，26%~50%计2 分，＞51%计3 分，染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性细胞占比和染色强度的乘积≤3 为阴性（-），＞3 为阳性（+）。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计数资料以频次或百分比表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用Kendall 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织、癌旁组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达率比较 结直肠癌组织中 CCDC12、FOXO3a 、Twist、MMP-9 蛋白阳性分别为 62、43、52、65 例，阳性表达率分别为75.61%、52.44%、63.41%、79.27%；癌旁组织中CCDC12、FOXO3a 、Twist、MMP-9 蛋白阳性分别为16、77、14、19 例，阳性表达率分别为 19.51%、93.90%、17.07%、23.17%，与癌旁组织比较，结直肠癌组织中 CCDC12、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达率高，FOXO3a 蛋白阳性表达率低（χ2分别为51.733、36.613、51.640、35.906，P均＜0.05）。

2.2 不同临床病理参数的结直肠癌患者癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达率比较 不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤类型的结直肠癌患者癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义（χ2分别为1.386、1.853、2.629、0.003，1.167、0.602、0.183、2.231，0.721、0.007、1.143、0.005，0.471、3.401、0.012、0.490，P 均＞0.05），不同分化程度、TNM 分期、有无浆膜浸润、有无淋巴结转移的结直肠癌患者癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义（χ2分别为5.312、7.022、4.891、7.863，9.551、20.513、7.949、11.642，5.720、12.559、11.748、7.745，10.688、8.077、8.979、17.085，P 均＜0.05），不同临床病理参数的结直 肠 癌 患 者 癌 组 织 中 CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9蛋白阳性表达情况见表1。

2.3 结直肠癌组织中 CCDC12、FOXO3a、Twist 与MMP-9 蛋白表达相关性 结直肠癌组织中的CCDC12、Twist 蛋白表达与MMP-9 蛋白表达呈正相关（r=0.368、0.353，P＜0.01），FOXO3a 蛋白表达与MMP-9蛋白表达呈负相关（r=-0.205，P＜0.01）。

3 讨论

随着我国社会不断发展，人们的饮食习惯发生巨大改变，近年来结直肠癌的发病率逐年升高，此病早期无特异性症状，且发展迅速、侵袭转移快，患者确诊时多数已为进展期，预后较差。因此，对结直肠癌细胞增殖、侵袭机制进行探索对降低结直肠癌发病率极为重要［8］。目前已发现，结直肠癌发生、进展、侵袭、转移等为多种基因相互作用的结果，但具体机制仍未探明。

CCDC 蛋白家族系一类由2 个或2 个以上卷曲螺旋结构域构成的寡聚体或同寡聚体序列蛋白，而构成CCDC 蛋白的这些卷曲螺旋结构域结构特殊，使得CCDC 蛋白易出现空间构象改变，从而具有多种细胞生物学特性［9］。目前，已有研究报道证实CCDC 家族中的某些成员参与了细胞分化、周期调控、凋亡及遗传信号转录、细胞信号传导、分子识别等众多生物学过程。CCDC12 为CCDC 蛋白家族一员，近年报道发现其和结直肠癌发生相关［10］。本研究对比结直肠癌组织及癌旁组织中的CCDC12 蛋白表达情况发现，CCDC12 蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率升高，提示CCDC12 蛋白高表达可能和结直肠癌发生有关。此外，在低分化、TNM 分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤浸润至浆膜层、发生淋巴结转移的结直肠癌组织中CCDC12 阳性表达率更高。分析原因为CCDC12 蛋白高表达致使肿瘤细胞骨架重排，活化肿瘤细胞内丝裂原活化蛋白酶及信号磷脂酶C，从而使得肿瘤细胞发生运动及迁移［11］。

表1 不同临床病理参数的结直肠癌患者癌组织中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9蛋白阳性表达

FOXO 蛋白为FOX 蛋白家族亚群之一，在哺乳动 物 细 胞 中 主 要 以 FOXO1、FOXO3、FOXO4 及FOXO6蛋白形式存在，FOXO 蛋白在机体代谢、氧化应激、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及细胞信号传导等中起关键作用［12］。FOXO3a 作为 FOXO 家族一员，已被证实为抑癌基因之一，其亚细胞定位和磷酸化失活和肿瘤发生有关。李超等［13］研究表明，FOXO3a 蛋白在乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、尿路上皮癌等多种恶性肿瘤中表达降低，且和患者预后相关。本研究对比结直肠癌组织及癌旁组织中的FOXO3a 蛋白表达情况发现，FOXO3a 蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显降低，提示FOXO3a 蛋白低表达可能和结直肠癌发生有关。同时，FOXO3a蛋白低表达和结直肠癌分化程度、TNM 分期、浸润程度以及淋巴结转移有关，FOXO3a 蛋白表达降低，结直肠癌分化程度降低，TNM 分期增高，浸润程度加深，发生淋巴结转移，说明FOXO3a 可抑制结直肠癌侵袭转移。究其原因为FOXO3a 蛋白表达降低，细胞周期停止效应减弱，利于肿瘤细胞增殖；FOXO3a 蛋白表达降低，机体修复DNA 损伤能力降低，导致基因组不稳；FOXO3a 蛋白表达降低，细胞凋亡减少，促进肿瘤细胞扩展［14］。

Twist 为一种广泛存在于人、鼠、果蝇等体内的高度保守转录因子，主要在来源于胚胎中胚层、胎盘及成人某些中胚层中的未分化组织内表达，是促进胚胎发育关键因子［15］。上皮—间质细胞转化（EMT）是指稳定静止状态的上皮细胞细胞连接与极性的丧失并获得间质细胞的表型特征，为发育过程中细胞的生理性重编程现象。近年研究表明，EMT 与肿瘤的发生、进展密切相关，肿瘤细胞出现EMT 即视为肿瘤细胞开始侵袭、转移［16］。Twist为调控EMT过程的关键因子，被认为和肿瘤细胞侵袭转移有关。本研究对比结直肠癌组织及癌旁组织中的Twist 蛋白表达情况发现，Twist 蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显升高，表明Twist蛋白高表达可能和结直肠癌发生有关。另外，Twist 蛋白高表达和结直肠癌分化程度、TNM 淋巴结转移有关，其机制分析为Twist蛋白高表达，可与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（ARF）结合来抑制其表达，从而调控P53 凋亡信号通路，促进肿瘤细胞增殖、分化，并抑制细胞凋亡，使TNM 分期升高；Twist 蛋白高表达，抑制E-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达，而E-Cadherin 表达降低或缺失为EMT发生关键［17］。

肿瘤细胞中基质降解为肿瘤细胞侵袭转移的重要条件之一。基质金属蛋白酶（MMPs）几乎能降解细胞外基质（ECM）中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭、转移中起关键性作用。MMP-9 又叫明胶酶B，属于MMPs 家族一员，被证实和多种恶性肿瘤的侵袭、转移有关。ZHAO等［18］报道表明，MMP-9 能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型等胶原及明胶，从而促进肿瘤细胞发生浸润性转移。杨菊等［19］研究则指出，MMP-9 可促进肿瘤微淋巴血管形成，从而促进肿瘤细胞发生淋巴结转移。本研究对比结直肠癌组织及癌旁组织中的MMP-9 蛋白表达情况发现，MMP-9 蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显升高，表明MMP-9 高表达可能和结直肠癌发生有关。MMP-9 高表达和结直肠癌分化程度、TNM 分期、浸润程度以及淋巴结转移有关，考虑可能与MMP-9 降解细胞外基质，削弱其组织学屏障作用及释放血管内皮生长因子参与血管生成有关。

进一步分析结直肠癌组织中的CCDC12、FOXO3a、Twist 表达与 MMP-9 表达相关性发现，CCDC12、Twist 与 MMP-9 呈正相关，而 FOXO3a 与MMP-9 呈负相关。分析原因为：CCDC12 可能通过调控CyclinD1 蛋白表达间接促进MMP-9 分泌，其中CyclinD1蛋白为启动细胞周期的重要蛋白，而MMP-9 参与的肿瘤新生血管形成过程与细胞异常增殖有关；FOXO3a 可促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体表达抑制MMP-9合成，此外FOXO3a表达降低，会激活Wnt 信号通路，从而使MMP-9 表达升高；Twist所介导的EMT 过程中抑制了基质金属蛋白酶组织抑制因子1表达，从而间接使得MMP-9表达上升。

综上所述，结直肠癌组织中的CCDC12、Twist、MMP-9表达升高，而FOXO3a表达降低，其表达和结直肠癌分化程度、TNM 分期、浸润程度以及淋巴结转移有关；CCDC12、FOXO3a、Twist 均间接或直接调控结直肠癌组织中的MMP-9 表达来参与结直肠癌的发生、进展、侵袭、转移等生物学行为。