肝细胞癌根治性切除术患者术前血清AFP、VEGF水平及肿瘤组织Ki-67表达水平与早期复发的关系

龚培贤，孙涛，刘金玮，范正军

郑州大学第一附属医院肝胆胰外科，郑州450052

原发性肝癌（PLC）是世界上最常见的癌症之一，在我国其发病率和病死率分别居癌症第5 位和第2位，严重危害民众的生命健康和生活质量［1］。其中最常见的种类是肝细胞癌（HCC），占比达90%［2］。目前肝癌根治性切除术是HCC 最有效的治疗方式，不过其远期治疗效果并不乐观，术后5 年复发率可达到70%，较高的复发率已成为影响HCC 预后的主要因素［2］。因此，如能找到HCC 术后早期复发的影响因素，对早期复发进行预测并及早干预可能会改善HCC的预后。但是，目前对于HCC术后早期复发的影响因素并不明确。甲胎蛋白（AFP）是一种糖原蛋白，是临床上最常用来筛查HCC 的特异性血清学指标［3］。研究显示，血清 AFP 浓度是 HCC 术后复发的独立危险因素，对监测肿瘤复发具有一定价值。血管生成在癌症的生长和转移中具有关键作用，血管内皮生长因子（VEGF）是一种促血管生成因子，在肿瘤血管的形成和通透性调节的过程中必不可少，与肿瘤的发生、发展有显著相关性［4］。Ki-67 是一种增殖细胞标记抗原，可反映细胞增殖水平［5］。本研究拟对HCC 患者术前血清AFP、VEGF 浓度及肿瘤组织中Ki-67 表达水平与术后早期复发之间的关系进行探讨，为预测肝癌术后早期复发提供可行的临床指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料 郑州大学第一附属医院肝胆外科2017年1月—2019年5月施行根治性切除术的HCC患者145例，男111例（76.6%）、女34例（23.4%），男女性别比为3.3∶1，年龄26~79（55.8 ± 9.9）岁、中位年龄57岁。纳入标准：首次接受HCC根治性切除手术；病理类型为HCC；术前Child-Pugh 肝功能分级A/B级；术前未接受靶向药物、肝动脉化疗栓塞等其他方式治疗。排除标准：病理类型为胆管癌、转移性肝癌或混合细胞癌；肝癌侵犯周围组织或有转移；患有其他恶性肿瘤或威胁生命的严重疾病；资料不全和失访。

1.2 术前血清AFP、VEGF 的检测 采空腹肘静脉血 5 mL，肝素抗凝后以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存。采用ELISA 法（试剂盒选用罗氏公司产品）检测血清AFP、VEGF。

1.3 肿瘤组织Ki-67 的检测 采用免疫组织化学法。术中取HCC 组织，标本均经固定、脱水、石蜡包埋，常规切片后采用免疫组化SP法染色。一抗为鼠抗人Ki-67 单克隆抗体，以PBS 溶液代替一抗为阴性对照。DAB 显色，苏木精复染。细胞核内出现棕黄色颗粒为Ki-67 表达阳性，每张切片随机观察至少5 个高倍视野，每个视野计数200 个细胞，Ki-67阳性细胞所占百分数即为Ki-67增殖指数。Ki-67增殖指数≥20%定义为高表达。

1.4 随访 术后连续3个月、每个月复查1次，包括肿瘤标记物、肝肾功能等血清学检测以及肝脏超声、腹部CT 等影像学检查，之后每隔3 个月复查1 次。以2种及以上影像学检查再次显示HCC的血供特征或穿刺病理诊断为HCC判定为术后复发［6］。无复发生存时间（RFS）定义为手术日至首次确诊肿瘤复发转移的时间。一旦复发则随访结束，未复发者继续随访，至2021-05-31 随访终止。随访时间1~51 个月，中位随访时间26个月。以术后2年为时间节点，把患者分为复发组（≤2 年，63 例，43.4%）和未复发组（＞2年，82例，56.6%）。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料用例和百分比（%）表示，比较用χ2检验或Fisher确切概率法。对有统计学意义的因素纳入Cox 比例风险回归进行多因素分析。采用受试者工作特征曲线（ROC）评估各指标对HCC 术后早期复发预测的准确度。以术后复发转移为结局事件，如随访结束仍未复发则为删失事件，采用Kaplan-Meier 法估计肝细胞癌患者术后RFS，采用Log-Rank 检验比较肝细胞癌术后有无复发患者的生存曲线。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复发与未复发组术前血清AFP、VEGF 浓度、肿瘤组织中Ki-67 表达水平及其他早期复发可能影响因素比较 术前一般情况：早期复发与未复发组年龄分别为（55± 10）、（56±10）岁；男性分别为52、59 例；肿瘤最大直径≤5 cm 分别为 37、62 例；单发肿瘤例数分别为 58、75 例；Child-Pugh A 级分别为 59、79 例；HbsAg 阳性分别为 52、59 例；肝硬化分别为44、56例；合并疾病分别为27、33例；吸烟分别为26、22 例；饮酒分别为16、11 例。两组间肿瘤最大直径比较，P=0.030，其余指标比较，P 均＞0.05。术前血清学指标：早期复发与未复发组AFP＞200 ng/mL 分别为 38、22 例；VEGF＞160 pg/mL 分别为 44、37 例；ALT＞40 U/L 分别为 21、22 例；AST＞40 U/L 分别为21、24 例 ；ALB＞35 g/L 分 别 为 52、69 例 ；TBIL＞25 μmol/L 分别为8、5 例。两组 AFP、VEGF 比较，P值分别为0.001、0.003，其余指标比较，P 均＞0.05。术后治疗方式：早期复发与未复发组患者术后 TACE 分别为 52、57 例；靶向治疗分别为 35、40例。两组比较，P 均＞0.05。术后病理资料：早期复发与未复发组合并脉管癌栓分别为26、21 例；微血管侵犯阳性分别为42、35 例；Ki-67 高表达分别为46、36例；Edmondson高分化分别为7、8例；TNM I 期分别为57、75 例。两组脉管癌栓、微血管侵犯、Ki-67 表达比较，P 值分别为 0.046、0.004、＜0.001，其余指标比较，P均＞0.05。

2.2 血清AFP、VEGF 浓度及肿瘤组织Ki-67 表达水平与HCC 术后早期复发的关系 术前AFP 浓度＞200 ng/mL、术前 VEGF 浓度＞160 pg/mL、Ki-67高表达均为HCC 术后早期复发的独立危险因素，见表1。

表1 HCC术后早期复发危险因素的多因素分析结果

2.3 血清AFP、VEGF 浓度和肿瘤组织Ki-67 表达水平检测对HCC 患者术后早期复发的预测效能 术前血清AFP 浓度检测预测HCC 患者术后早期复发的 cut-off 值为 72.17 ng/mL，AUC 为 0.742，OR 值 为 6.311，OR 值 的 95% 置 信 区 间（CI）为2.927~13.606，敏感度为81.0%，特异度为59.8%，阳性预测值为60.7%，阴性预测值为80.3%，约登指数为40.7%；术前血清VEGF 浓度检测预测HCC 患者术后早期复发的cut-off 值为368.20 pg/mL，AUC为 0.677，OR 值 为 14.625，OR 值 的 95% CI 为4.763~44.907，敏感度为42.9%，特异度为95.1%，阳性预测值为87.1%，阴性预测值为68.4%，约登指数为38.0%；术后肿瘤组织中Ki-67 增殖指数预测HCC 患者术后早期复发的cut-off 值为17.5%，AUC为 0.664，OR 值为 3.458，OR 值的 95% CI 为 1.705~7.011，敏感度为73.0%，特异度为56.1%，阳性预测值为56.1%，阴性预测值为73.0%，约登指数为29.1%；血清AFP、VEGF 浓度和肿瘤组织Ki-67增殖指数共同检测时预测HCC 患者术后早期复发的AUC 为0.762，敏感度为58.7%，特异度为89.0%，阳性预测值为80.4%，阴性预测值为73.7%，约登指数为47.8%。

2.4 不同血清AFP、VEGF 浓度及肿瘤组织Ki-67表达的HCC 术后早期复发患者RFS 比较 血清AFP≤200 ng/mL 的 HCC 术后早期复发患者平均RFS 为 39.33 个 月 ，＞200 ng/mL 者 平 均 RFS 为25.19 个月，两者比较，χ2=17.25，P＜0.001；血清VEGF≤160 pg/mL 的HCC 术后早期复发患者平均RFS 为 38.34 个月，＞160 pg/mL 者平均 RFS 为 29.28个月，两者比较，χ2=8.61，P=0.003；组织Ki-67 高表达的HCC 术后早期复发患者平均RFS 为28.72 个月，低表达者平均RFS 为37.53 个月，两者比较，χ2=11.67，P=0.001。

3 讨论

HCC 发生率高，恶性程度大，且术后早期复发率高，有效预防和采取合理措施及时干预治疗，对降低病死率、提高总体生存率和改善患者生活质量具有重大意义。因而选择较为准确可行的预测早期复发的相关指标显得尤为重要。一般认为，早期复发多出现在肝内，主要来源于原发病灶在肝内其他部位的微小转移以及术后微小病灶的残留，并且预后比晚期复发的患者较差，但是关于早期复发的时间界定尚存在争议。多数学者以术后2年为时间节点来划分早期复发（≤2年）与晚期复发（＞2年），不过也有研究人员以术后1年，甚至术后6个月为时间节点进行划分［7，8］。本研究145例HCC 患者中，63例患者术后2 年内出现复发，复发率为43.4%，这一结果与IMAMURA 等［9］的报道较为一致，所以我们以术后2年内出现的肿瘤复发为早期复发。

AFP 是诊断HCC 和监测术后复发最常用的血清学指标。血清AFP 的含量在正常成年人体内通常低于10 ng/mL，当肝脏再生或者发生癌变时AFP被激活，能够引起血清中AFP 含量的升高。血清中AFP的半衰期较短，术后通常会迅速下降，据此可对手术效果进行评估，如果持续在高水平或下降后再次升高则可能与肿瘤残留、复发或转移相关。有研究［10］显示，血清中高浓度的 AFP 与 HCC 的发生和转移呈正相关，并且AFP 在体内外均具有促进肝癌细胞转移的功能，这一机制可能与AFP 激活PI3K/AKT 信号通路的传导从而上调转移相关蛋白的表达有关。此外，AFP还可以导致DC细胞凋亡和功能障碍，影响T淋巴细胞的分化，进而抑制机体的免疫应答，协助肝癌细胞逃避免疫监视，促进癌细胞在患者体内的生长［11］。杨针等［12］研究显示，与血清 AFP阳性组相比，阴性组的术后复发率更低而无瘤生存率更高。本研究结果显示，术前血清AFP 浓度与HCC 术后早期复发显著相关，术前AFP＞200 ng/mL是HCC 术后早期复发的独立危险因素。术前AFP≤200 ng/mL 与 AFP＞200 ng/mL 的 HCC 患者相比术后早期复发率更低，而RPS 更长。这些结果表明，AFP浓度较高的HCC 患者术后更容易出现早期复发，并且预后往往较差。因此，对于术前AFP 浓度较高的患者，如AFP＞200 ng/mL，术后应定期复查，对可能存在的复发或转移早发现、早干预，可改善患者的预后、提高整体生存率。

新生血管在肿瘤的发生发展进程中有着至关重要的作用，而VEGF 是驱动血管生成的关键因素，进而能够促进HCC 细胞的生长和转移，对患者的预后有显著影响。VEGF 对肿瘤微环境中的免疫细胞还可以产生影响，导致其功能下降，从而降低宿主对癌细胞的免疫应答反应。张继红等［13］研究表明，VEGF 在肝癌组织中的表达量高于癌周组织，与无肝内转移的肝癌组织相比，有肝内转移的肝癌组织中VEGF 表达明显增强，进一步说明VEGF 高表达与HCC恶变及肝内转移密切相关。POON 等［14］的研究证实，血清VEGF 高浓度是HCC 切除术后预后不良的独立危险因素，与静脉侵袭和晚期肿瘤分期显著相关。本研究中，复发组的血清VEGF 浓度较未复发组显著升高；多因素分析表明，术前血清VEGF＞160 pg/mL 是HCC 术后早期复发的独立危险因素；Kaplan-Meier 曲线分析显示，术前VEGF≤160 pg/mL 和＞160 pg/mL 的 HCC 患者术后早期复发率分别为29.7%（19/64）和54.3%（44/81），平均RFS分别为38.34个月和29.28个月，两者术后生存曲线存在明显差异。说明术前VEGF 的浓度越高，则肿瘤的侵袭性越强，HCC患者的生存期越短。

Ki-67抗原是一种增殖细胞标记抗原，其表达与细胞有丝分裂过程关系紧密，一般被认为是细胞增殖的标志［5］。Ki-67 在肺癌、乳腺癌以及前列腺癌等多种恶性肿瘤中均有不同程度的表达，并且与其预后具有显著相关性。在一项纳入504 例样本的临床研究中，研究人员通过免疫组化的方法对Ki-67 在组织中的表达情况进行分析，结果发现，在正常组织、癌周组织以及肝癌组织中Ki-67 均有表达，并且在肝癌组织中表达最强，而且还与组织分化程度、淋巴结转移以及肿瘤TNM 分期密切相关，说明Ki-67高表达可能与肿瘤的发生、发展及预后相关［15］。LUO等［16］进行的一项 Meta 分析显示，高 Ki-67 指数与HCC 患者的组织学分级、肿瘤大小、肿瘤结节数、转移状态、肝硬化和静脉浸润等密切相关，而且对患者的无病生存率、无复发生存率和总生存率均会产生不利影响，Ki-67 可以作为HCC 患者临床恶化和预后不良的生物标志物。本研究复发组中Ki-67 高表达的患者占73.0%，较未复发组明显提升，Ki-67 高表达是HCC 术后早期复发的独立危险因素。Ki-67高表达与低表达的HCC 患者术后早期复发率分别为56.1%和27.0%，平均RFS 分别为28.72 个月和37.53 个月。说明Ki-67 高表达预示着HCC 术后的复发率高、预后差。

通过绘制术前血清AFP、VEGF 浓度和术后肿瘤组织中Ki-67 表达水平在不同cut-off 值下的ROC，我们发现三项指标对HCC 术后早期复发的预测均具有一定价值。AFP、VEGF、Ki-67预测HCC 术后早期复发的 AUC 分别为0.742、0.677、0.664；敏感度分别为81.0%、42.9%、73.0%；特异度分别为59.8%、95.1%、56.1%。从中可以看出AFP 有着更高的诊断效能，然而约有30%的HCC 患者血清AFP浓度保持在正常范围，其他一些疾病的患者也会有不同程度的升高，如妊娠、消化道肿瘤等，这也导致AFP 检测在HCC 诊断方面的价值存在一定局限性，因此不应单独用于预测HCC 的复发。三项指标共同检测时，AUC 提高至0.762，准确度为75.9%，说明共同检测较单项检测对于HCC 的术后复发具有更好的预测效能。

综上所述，术前血清 AFP＞200 ng/mL、VEGF＞160 pg/mL 以及术后肿瘤组织中Ki-67 高表达是HCC 术后早期复发的独立危险因素；对HCC 术后早期复发的预测具有较好的效能，以三项指标联合预测效能最高；术前血清 AFP＞200 ng/mL、VEGF＞160 pg/mL 以及术后肿瘤组织中Ki-67 高表达的HCC 患者术后RFS 明显缩短。在临床工作中，对于HCC 患者，可根据血清AFP、VEGF 浓度及肿瘤组织中Ki-67 表达水平，以及影像学检查等评估患者的预后，以实现肿瘤的个体化治疗。