逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统构建

张野，陈静，王佩佩，林伟，王建勋，2

1 北京中医药大学生命科学学院，北京 102488；2 深圳北京中医药大学研究院

SynNotch 系统自开发以来，一直依赖于慢病毒载体进行构建，但使用慢病毒载体生产CAR-T 细胞也具有一定的局限性，慢病毒载体的生产方式及纯化工艺较为复杂，一定程度上限制了生产规模的放大［3］。目前尚未有报道使用逆转录病毒载体构建SynNotch 系统［4-8］。这可能是因为逆转录病毒载体两端的末端重复序列（LTR）中含有强启动子及增强子等元件，这些元件可能会对SynNotch 门控系统造成干扰，使其下游靶基因无法受到门控元件的调控，但逆转录病毒载体在生产方面拥有独特的优势，且成本较低。在本研究中，我们对逆转录病毒载体进行设计优化，将效应基因反向插入到载体中，旨在避免LTR 启动子对效应基因的干扰，同时引入绝缘子元件（insulator）。绝缘子是一类能够保护基因座独立性的DNA 序列元件，它能够维持染色质区域的分界，在基因工程中的作用是保护外源基因不受插入位点邻近基因增强子和沉默子的影响。同时，在基因治疗病毒载体两端引入绝缘子元件可以降低或消除基因毒性［9］。因此，我们挑选了两种先前报导的有效绝缘子序列，分别为19 号染色体和1 号染色体上的一段CTCF 结合序列［10］，分别将其命名为IC19和IC1，插入到构建的逆转录病毒载体两端，一方面旨在降低逆病毒载体的基因毒性，另一方面，也希望绝缘子能够发挥其增强子阻断功能，降低LTR 对效应基因的干扰作用。基于以上设计，我们构建了一种新型的逆转录病毒介导的SynNotch 门控系统，希望为CAR-T细胞疗法提供一种新的选择。

1 材料与方法

1.1 实验用细胞、试剂、仪器 293T 细胞购自国家实验细胞资源共享平台，逆病毒包装细胞系均购自美国ATCC 细胞库。DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）和胰酶均购自美国Gibco 公司。转染试剂FuGene HD 购自美国Promega 公司。无缝克隆试剂盒、质粒大提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。病毒RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒及SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒均购自德国QIAGEN 公司。荧光素酶检测试剂Bright-Lumi购自碧云天生物技术公司。实验所用主要仪器包括PCR仪、流式细胞仪，购自美国伯乐公司；琼脂糖水平电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪，购自美国Life Technologies公司。

1.2 逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统的设计 SynNotch门控系统的构建需要在两个载体上进行，我们将携带门控作用分子的载体称为门控载体，另一个称为效应载体。SynNotch 门控载体使用Gal4-VP64 元件构建，删除胞外识别序列和跨膜Notch 蛋白序列，只保留Gal4-VP64 元件，并加上荧光标签蓝色荧光蛋白（BFP）序列（图1）。效应载体一共设计了6 种，分为2 组。一组为正向设计，一组为反向设计。每组分为不加绝缘子，加1 个绝缘子和2 个绝缘子。效应载体是以UAS 作为诱导启动子，绿色荧光蛋白（EGFP）及荧光素酶（luciferase）作为报告基因，通过观察报告基因的表达评估Syn-Notch 门控系统的功能［2］（图 2）。将 7 种载体分别命名为GPB、UEL、UEL19、UEL191、LEU、LEU19、LEU1 19，其 中 UEL、UEL19、UEL191 为 正 向 序 列 设计，LEU、LEU19、LEU119为反向序列设计。

图1 SynNotch门控质粒分子设计示意图

图2 SynNotch效应质粒分子设计示意图

1.3 逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统的构建

1.3.1 SynNotch 系统的门控质粒及效应质粒的构建 首先进行质粒的构建，目的片段Gal4-VP64 及EGFP-luciferase 采 用 PCR 扩 增 ，pMFG 载 体 使 用Xhol/Notl 双酶切。PCR 及酶切产物采用凝胶电泳鉴定并进行胶回收及纯化，使用无缝克隆试剂盒分别对目的片段Gal4-VP64、EGFP-luciferase 与pMFG载体进行连接，得到7 种连接产物。连接产物用DH-5α感受态细胞进行转化，转化后涂板，在氨苄抗性的LB 固体培养基上培养过夜，第二天挑取5~10个单克隆，加入到氨苄抗性的LB 液体培养基中，摇床培养12~16 h，分别提取菌液的质粒DNA 酶切进行初步鉴定，挑选阳性质粒进行测序，测序成功后进行质粒的大提及纯化。成功构建了1个门控质粒及6个效应质粒。

1.3.2 SynNotch 门控系统的逆转录病毒载体构建及逆转录病毒滴度检测 分别对上述成功构建的1个门控质粒及6 个效应质粒进行逆转录病毒的包装。首先，将构建好的7 个质粒分别转染逆转录病毒包装细胞系，转染试剂采用FUGENE 试剂，转染后48 h收集病毒上清并分别检测门控质粒和效应质粒报告基因的表达。此外，为了在质粒水平上初步验证SynNotch 门控系统的功能，我们对6 个效应质粒分别进行了双质粒转染，将门控质粒及效应质粒共转染包装细胞，48 h 后在显微镜下观察效应质粒EGFP的表达情况。

将上述步骤收集的病毒上清用0.45 μm的滤膜过滤后置于-80 ℃冰箱保存，并通过滴度检测检验病毒载体的构建是否成功。滴度检测采用实时荧光定量PCR 法，首先提取病毒RNA，进行逆转录得到cDNA，再将cDNA 进行荧光定量扩增，根据CT 值计算病毒滴度。

1.4 构建的逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统的验证 SynNotch门控系统的构建一般需要将门控载体和效应载体共转导受体细胞，从而发挥功能。为了验证本研究构建的SynNotch 门控系统的功能，我们将构建的6 种效应载体分别与门控载体共转导293T 细胞，同时将6 种效应载体单独转导293T 细胞作为对照组，通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测诱导前后报告基因的表达情况，评估效应基因是否成功受到门控元件Gal4-VP64 的调控。将293T细胞分为未诱导组和诱导组，未诱导组为效应载体单独转导的293T细胞，诱导组是在未诱导组的基础上增加一次门控载体GPB 的转导，共分为 12 组，将 12 个组分别命名为 UEL、UEL19、UEL191、LEU 、LEU19、LEU119 以 及 G-UEL、G-UEL19、G-UEL191、G-LEU、G-LEU19、G-LEU119。

创新是事物发展的源泉，改革是事物发展的不竭动力，新时代我国群众体育领域研究应当以健康中国战略为引领，关注城乡群众体育协调发展，以全民健身战略为引领，关注群体与竞体的协调发展，以体育强国战略为引领，关注我国群众体育文化发展，从而最终实现我国群众体育的全面、可持续发展。

1.4.1 293T 细胞的转导 转导前一天用Retronectin 试剂铺 12 孔板，第 2 天从-80 ℃冰箱中取出包装好的病毒，恢复至室温后进行转导。转导第一天进行效应载体单病毒的转导，每孔2×105个细胞，离心后加入病毒重悬，置于37 ℃细胞培养箱孵育，转导完成后去除病毒上清，加入含10%FBS 的DMEM 培养基培养过夜。转导第2 天取单病毒转导后的细胞置于一个新的12 孔板再次进行门控病毒载体的转导，得到双病毒载体共转导的293T细胞，转导条件与第1 天相同。将单转和双转后的293T 细胞置于37 ℃细胞培养箱培养，48 h 后检测每组效应基因。

1.4.2 效应基因EGFP 及Luciferase 的检测 采用流式细胞术及荧光素酶发光实验。转导后48 h，对293T 细胞进行处理。用胰酶将其消化成单个细胞后进行细胞计数，每组取2×105个细胞进行流式检测，取1×105个细胞进行荧光素酶发光检测，以空白293T 细胞作为对照组。流式检测的细胞离心后用PBS洗涤1~2遍，再加入500 μL PBS重悬，设置FITC通道，检测每组的EGFP 荧光强度。荧光素酶发光检测使用不透明的白色酶标板，细胞悬液和荧光素酶底物各加入100 μL，室温避光放置5 min 后使用酶标仪检测，设置化学发光（LUM）模式，检测每组luciferase的荧光强度。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0 软件。正态性检验采用Shapiro-Wilk 检验。计量资料以表示，两组间比较采用 t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统在质粒水平上的初步验证结果 质粒转染病毒包装细胞后48 h，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况，门控质粒表达蓝色荧光（BFP），荧光显微镜下显示强荧光。效应质粒表达绿色荧光（EGFP），单质粒转染结果显示，UEL、UEL19、UEL191 三组有荧光表达，但荧光强度一般；LEU、LEU19、LEU119 三组几乎无荧光表达。双质粒转染结果显示，6 组效应质粒均有较强荧光表达。

2.2 逆转录病毒载体滴度检测结果 对包装的7个逆转录病毒载体进行滴度检测，使用实验室前期成功构建的逆转录病毒载体作为阳性对照，结果显示，本实验制备的逆病毒载体滴度均在107~108copies/mL之间，且不低于阳性对照。

2.3 逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统的功能验证结果

2.3.1 各组 EGFP 的表达 效率 UEL、UEL19、UEL191 三组单病毒转导的293T 细胞EGFP 的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%，G-UEL、G-UEL19、G-UEL191 三组双病毒转导的 293T 细胞EGFP 的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。正向设计载体转导后的293T 细胞在未诱导时EGFP 已有较强表达，其中未加绝缘子的UEL 组表达最强。LEU、LEU19、LEU119 三组单病毒转导的293T 细胞EGFP 的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%，表达均较弱或几乎无表达，但G-LEU、G-LEU19、G-LEU119 三组双病毒转导的293T 细胞EGFP 的表达效率分别为59.9%、77.9%、89.5%。反向设计载体转导后的293T 细胞在未诱导的情况下EGFP 几乎不表达，诱导后显示较强表达。

UEL 组、UEL19 组、UEL191 组、LEU 组、LEU19组、LEU119 组诱导前EGFP 平均荧光强度分别为（287.35 ± 68.14）×103、（41.69 ± 14.20）×103、（48.68 ± 11.78）×103、（7.37 ± 2.44）×103、（7.37 ±2.57）×103、（8.97 ± 3.28）×103，诱 导 后 分 别 为（701.50 ± 75.66）×103、（268.90 ± 43.34）×103、（328.73 ± 11.74）×103、（50.02 ± 2.35）×103、（88.02 ± 8.97）×103、（297.52 ± 3.80）×103，6 组效应载体诱导前后EGFP 荧光强度比较，P 均＜0.05。正向设计组（UEL 组、UEL19 组、UEL191 组）在未诱导时，载体的自我表达均较强；反向设计组（LEU组、LEU19 组、LEU119 组）中，效应基因在未诱导时几乎无背景表达，且在诱导后呈现较强表达，其中反向双绝缘子的设计在诱导前后荧光强度差异最为显著（P＜0.01）。

2.3.2 各组 luciferase 的表达效率 UEL、UEL19、UEL191、LEU、LEU19、LEU119 组诱导前 luciferase的荧光强度分别为（483.00± 36.77）×103、（65.40±3.54）×103、（79.00 ± 0.99）×103、（0.38 ± 0.01）×103、（0.61 ± 0.07）×103、（2.09 ± 0.12）×103，诱导后luciferase 的 荧 光 强 度 分 别 为（599.00 ± 9.89）×103、（235.50 ± 3.54）×103、（139.00 ± 2.83）×103、（20.05 ± 2.05） ×103、（38.15 ± 1.20） ×103、（129.50 ± 2.12）×103。UEL、UEL19、UEL191、LEU1 9、LEU119 组诱导前、后 luciferase 荧光强度相比，P均＜0.01。其中LEU19 组双病毒转导与单病毒转导相比，表达效率提高了62.54 倍（诱导后与诱导前荧光强度的值相比），LEU119 组提高了61.96 倍，且这两组在单病毒转导的情况下几乎无表达。

3 讨论

CAR-T细胞疗法在治疗恶性血液肿瘤中已经显示出了良好的效果，但其治疗实体瘤仍存在一定的挑战［11-12］。主要原因是在实体瘤中，只有极少数抗原是真正的肿瘤特异性抗原，因此CAR-T 细胞在杀伤肿瘤细胞时会对正常组织细胞造成损伤。而Syn-Notch受体可以很好地克服这一问题，它可以通过门控系统特异性识别抗原从而启动杀伤功能［13］。因此，在过去的几年里，研究者们致力于通过构建Syn-Notch 系统来提高CAR-T 细胞对实体瘤的治疗效益，其中在治疗胶质母细胞瘤及神经母细胞瘤方面的研究中已经体现出了一定的效果。

SynNotch 门控系统是基于传统的Notch 信号通路改造而来。Notch蛋白是一种跨膜受体，它包含三个结构域：胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域。其胞外结构域含有一个Notch 受体，胞内结构域含有一种转录调节因子及一个剪切位点，当细胞外的配体与受体结合时，Notch 蛋白在剪切位点被剪切，就会诱导胞内的转录调节因子从膜上释放出来并与下游蛋白结合，从而完成信号的传递。而SynNotch 系统是将Notch 信号通路的胞外结构域用单链抗体或纳米抗体替换，胞内结构域用相应的效应器（如转录激活或转录抑制元件）替换，仅保留Notch 蛋白的中央核心调控区域而构建的一种门控系统［14］。SynNotch 通路中采用 Gal4/UAS 系统作为基因表达调控系统，其中，Gal4 是转录调控因子，UAS 是上游激活序列，只有当Gal4 的结合域与UAS结合后，才能激活靶基因的转录从而诱导其表达［15-16］。

人工合成的融合转录因子Gal4 -VP64 是Gal4蛋白改造后的产物，具有更强的调节功能［17］。在SynNotch 系统的剪切位点后插入Gal4-VP64 融合蛋白序列，同时在下游靶基因的启动子前插入UAS 序列，在胞外抗原存在时，SynNotch 系统将会识别并工作，SynNotch 蛋白发生剪切，Gal4-VP64融合蛋白与细胞膜脱离并进入细胞核，与靶基因启动子前的UAS 序列识别并结合，使靶基因高效表达（图3）。

在过去的几年中，对于SynNotch CAR-T 的研究都是基于慢病毒载体的构建。这可能是由于Syn-Notch 系统的效应基因需要受门控载体的调控才能表达，在慢病毒载体中，其5’LTR 的启动子不具有活性，可以灵活使用外源启动子来驱动目的基因的表达；而逆转录病毒载体只能依赖于自身的5’LTR启动子完成外源基因的表达，这就导致效应基因的表达可能不受门控载体的调控，从而干扰SynNotch门控系统的功能。因此，构建逆转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统需要对逆转录病毒载体进行设计和改造。

本研究通过对逆转录病毒载体进行设计改造，构建了一种基于逆转录病毒载体的新型SynNotch门控系统，并在质粒水平及病毒水平进行验证。质粒转染病毒包装细胞后48 h，单质粒转染结果显示，UEL、UEL19、UEL191 三组有荧光表达，但荧光强度一般；LEU、LEU19、LEU119 三组几乎无荧光表达。双质粒转染结果显示，6 组效应质粒均有较强荧光表达，在新构建的逆转录病毒载体SynNotch 门控系统中，反向序列设计可以阻断逆转录病毒载体两端的LTR 序列对下游靶基因的启动作用，Gal4-VP64转录因子成功诱导效应质粒中报告基因的表达。在在质粒水平上初步验证了转录病毒载体介导的SynNotch 门控系统的成功构建。进一步对包装的7个逆转录病毒载体进行滴度检测，使用实验室前期成功构建的逆转录病毒载体作为阳性对照，结果显示，本实验制备的逆病毒载体滴度均在107~108copies/mL之间，且不低于阳性对照，这说明此次逆病毒载体构建成功，与上述质粒水平的验证结论一致。

图3 SynNotch系统示意图

本研究进一步对转录病毒载体介导的Syn-Notch 门控系统进行功能验证，结果显示，正向设计载体转导后的293T 细胞在未诱导时EGFP 已有较强表达，这表明逆转录病毒的LTR 结构可以启动正向序列的效应基因表达，使其不受Gal4-VP64 元件的调控，其中，未加绝缘子的UEL 组表达最强。LEU、LEU19、LEU119 三组单病毒转导的 293T细胞EGFP 的表达均较弱或几乎无表达，但G-LEU、G-LEU19、G-LEU119 三组双病毒转导的 293T 细胞EGFP 的表达效率较高。说明反向设计载体转导后的293T 细胞在未诱导的情况下EGFP 几乎不表达，诱导后显示较强表达。UEL 组、UEL19 组、UEL191组、LEU 组、LEU19 组、LEU119 组效应载体诱导前后EGFP 荧光强度比较，P 均＜0.05。正向设计组（UEL 组、UEL19 组、UEL191 组）在未诱导时，载体的自我表达均较强；反向设计组（LEU 组、LEU19组、LEU119 组）中，效应基因在未诱导时几乎无背景表达，在诱导后呈现较强表达，其中反向双绝缘子设计的载体转导后的293T 细胞在诱导前后效应基因荧光强度差异最为显著。UEL、UEL19、UEL191、LEU19、LEU119 组诱导前、后 luciferase 荧光强度相比差异有统计学意义，LEU19 组双病毒转导与单病毒转导相比，表达效率提高了62.54倍，LEU119 组提高了61.96 倍，且这两组在单病毒转导的情况下luciferase 几乎无表达。证明反向设计在SynNotch 系统中均具有可行性，其中加双绝缘子设计的载体介导的SynNotch 门控系统的诱导效果较好。

综上所述，本研究成功构建了一种新型的SynNotch 门控系统，并验证了此门控系统的可行性，为后续SynNotch 系统的研究提供了实验依据和新的思路，也为将来的CAR-T 细胞疗法提供了一种新的途径，增强了其在临床治疗中的安全性，进一步推动了CAR-T 细胞治疗实体瘤的发展。但是，本实验也具有一定的局限性，虽然反向设计加上绝缘子可以成功使效应基因受到Gal4 信号的调控，但与正向设计相比，Gal4 的诱导表达效果还不够强。另外，本研究只是初步验证了SynNotch 系统在逆转录病毒载体上的可行性，是否能够成功构建双特异性的CAR-T 细胞还有待进一步研究。