基于ISSR分子标记的冬种马铃薯品种遗传多样性分析

陈兆贵，张荃锋，卢晓琪，郑希绵

（惠州学院生命科学学院，广东 惠州 516007）

马铃薯是第四大粮食作物，中国是全球最大的马铃薯生产国，在保证国家粮食安全方面具有重要的意义。惠州市作为我国冬种马铃薯的主要生产基地，由于种植的品种较为单一，在生产上存在较大的风险，有必要进一步扩大引种的品种资源[1]。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats 简单序列重复区间）是由Zietkiewicz[2]等基于SSR 技术发展起来的一种新型分子标记技术，具有重复性好、稳定性高、多态性高等优点，已广泛应用于植物种质资源鉴定领域以及不同品种植物的遗传多样性分析[3-6]，在马铃薯种质资源鉴定上也有应用[7-8]。

利用ISSR 分子标记技术对惠州冬种马铃薯生产基地引种的36 份来源不同的马铃薯种质资源进行遗传多样性分析，为惠州地区冬种马铃薯引种提供坚实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为引进的冬种马铃薯品种，共36 个（见表1），由惠州市惠东县油麻地马铃薯种植基地提供。在马铃薯生长中后期，每个品种取2～3 片叶，放到-80℃冰箱保存。

表1 用于ISSR-PCR 分析的马铃薯材料

1.2 马铃薯DNA 提取

采用艾科瑞生物工程有限公司植物DNA 提取试剂盒提取马铃薯叶片DNA，用超微量核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的浓度和纯度，保存于-20℃备用。

1.3 多态性引物筛选和扩增

引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，以提取的2 号和3 号2 个马铃薯品种DNA 为模板，筛选出选9 条引物，按优化好的反应条件进行扩增，扩增后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

1.3.1 PCR 反应体系 反应体系：12.5 μL Taq 预混液，10.5 μL RNase-free 水，1 μL 引物，1 μL DNA 模板，共25 μL。

1.3.2 PCR 反应条件 PCR 反应条件参考何海旺等[1]的方法，94℃预变性7 min；94℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸2 min，35 次循环；72℃延伸10 min，12℃保温。

1.4 数据处理

通过ISSR-PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图，进行人工读带，以DL 8 000 DNA Maker 作为标准分子量，引物对每个条带扩增的位点为基础，记录引物的扩增位点，有条带的记作“1”，没有条带的记作“0”。对每张电泳结果图进行统计，将数据统计成0 和1 矩阵。后续将利用NTSYS-pc 2.10 e 分析软件对矩阵数据进行分析，并制成系统聚类图。

2 结果与分析

2.1 总DNA 质量分析

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA，结果表明，所提取的DNA 质量较好，总DNA 条带清晰、均匀，无DNA 大量降解现象。经微量紫外分光光度计检测，OD260/OD280比值均在1.8 左右，说明提取的 DNA 纯度较高，符合PCR 扩增的要求。

2.2 ISSR 引物筛选和扩增

以2 号、3 号马铃薯DNA 模板，对所有引物进行PCR 扩增电泳（图1），从15 个引物中筛选出9 个条带比较清晰、数量比较多的引物。

图1 15 种引物筛选结果

从表2 可知，用筛选出的9 个引物对36 份马铃薯品种进行PCR 扩增，共得到81 条清晰的条带，平均每个引物可扩增出9 条条带。这些条带位于100～3 000 bp 范围内，其中多态性条带有65 条，平均每个引物可以扩增出7.22 条多态性条带，平均多态性条带比率达80.25%（引物ISSR 6、ISSR 14 引物扩增产物结果见图2、图3）。表明ISSR 技术可以有效展示各个马铃薯材料之间的多态性。

图2 引物ISSR6 扩增结果图

图3 引物ISSR14 扩增产物结果图

表2 ISSR 引物的扩增情况与多态性条带比率

2.3 各马铃薯材料之间的多态性分析

采用NTSYS-pc 2.10 e 软件分析36 个马铃薯品种遗传相似系数，并构建聚类树状图（图4），36 个马铃薯品种之间的遗传相似系数为0.78～0.91。其中遗传相似性最高的是华渝5（28 号）和黑金刚（29 号），遗传相似系数为0.91，说明这2 个马铃薯品种亲缘关系较为接近。

图4 36 种马铃薯的聚类树状图

以遗传相似系数0.80 为阈值可以把36 种马铃薯材料分为4 大类。第一大类有2 个品种，分别是云薯306（4 号）和云薯608（9 号）；第二大类有4 个品种，包括中薯28（22 号）、中薯红1 号（23 号）等品种，第二大类又可分为2 个亚类；第三大类有5 个品种，包括粤农薯6 号（7 号）、陇10（30 号）等品种，其中可分为2 个亚类；余下的25 个品种聚为第四大类，第四大类在遗传相似系数0.81 处可分为2 个大亚类。

3 讨 论

一直以来，我国多是使用传统育种方法来进行作物育种，通过对亲本的性状和生化指标来进行分类鉴定，再通过优良的亲本来进行杂交育种，虽然这些方法简单，也可培育出产量高、抗性好的优良品种，但是也有难以改善的缺点，如花费大量时间、人力、物力和精力来进行分类，培养过程中也容易受到环境的影响。ISSR 分子标记是基于PCR 技术发展起来的一种DNA 多态性检测技术[9]。与传统的分类鉴定等方法相比较，ISSR 分子标记技术不易受环境因素影响，且可以快速而准确地鉴别亲本间的亲缘关系，让育种工作变得更加简便快捷，因此被广泛应用在动植物的品种鉴定、遗传多样性检测等研究领域中[10-13]。马铃薯属于多倍体作物，育种可能性较之其他作物更加多样，但是也容易发生变异，这样也就造成马铃薯依据传统育种方法（通过亲本的性状）来进行分类鉴会存在偏差。ISSR 分子标记技术较于其他的分子标记技术，可以无需知道任何靶序列的SSR 背景信息，且ISSR 标记通过使用比RAPD 引物更长的引物，克服了RAPD 标记稳定性和重复性差的缺点，具有操作性好、遗传多态性高、重复性好等优点，可以在短时间内构建作物的基因指纹图谱[14]。

利用9 个ISSR 引物从36 份马铃薯样品中得到81条清晰的条带，其中多态性条带有65 条，多态性条带比率达80.25%。与赵永秀等[15]的多态性条带比率（93.38%）结果相差较远，说明引进的36 个马铃薯品种物种水平上遗传多样性丰富度一般。聚类分析结果表明，36 个马铃薯品种遗传变异程度较为一般，部分品种间遗传相似系数接近于1、亲缘关系较为接近，并且呈现出地域差异小的情况。该研究结果可为这36个马铃薯品种在以后的杂交育种中亲本选配提供依据，并为进一步研究马铃薯种质鉴定分类提供参考。