水稻OsSBEIIb 基因的克隆和时空表达特征及SNP位点多态性

李 辉，龚 辉，唐映红，程新奇

（1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2，湖南省棉花科学研究所，湖南 常德 415000）

近年来，随着中国经济社会发展，居民生活水平不断提高，高血压、糖尿病等很多慢性疾病的患者人数日益增多，这些慢性疾病已经严重威胁到了人们的身体健康。研究表明富含抗性淀粉的食物对这些疾病具有很好的预防效果[1-2]。抗性淀粉（Resistant Starch,简称RS）是指在健康人体的小肠中不能被消化吸收，但在大肠中能够被益生菌发酵分解的淀粉[3-4]。食用抗性淀粉可以增加饱腹感、降低动物血清总胆固醇浓度、降低餐后血糖水平、对于非胰岛素依赖型糖尿病和心血管疾病等具有辅助治疗作用[5-6]。同时，抗性淀粉还具有减少肠机能失调及结肠癌发病率、提供能量以及防止脂肪堆积等重要生理功能[7-8]。稻米成分主要包含支链淀粉、直连淀粉和抗性淀粉，多数水稻品种的抗性淀粉含量在1%左右，只有少数接近3%[9]。因此，选育富含抗性淀粉的水稻品种对保持人类健康具有重要意义。

稻米淀粉的形成是一个复杂的生理生化过程，需要一系列酶的共同催化，催化淀粉合成的酶主要包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase，AGP）、淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）和淀粉脱支酶（Starch debranching enzyme，DBE）。葡萄糖焦磷酸化酶是催化淀粉合成的第一个关键调控步骤。淀粉合成酶的功能是将葡萄糖残基加到引物的非还原端延长葡聚糖的线性糖链。淀粉合成酶有颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS，包括GBSSI 和GBSSII）和可溶性淀粉合成酶（SSS）。GBSS 主要生物学功能是延长葡聚糖链，形成高聚合度的直链淀粉[10]。GBSSI 由Wx基因编码，Wx基因突变体胚乳总淀粉含量变化不明显，但是直链淀粉含量显著减少甚至完全缺失[11-13]。SSS 有4 种同工酶，负责支链淀粉的生物合成，催化较低葡萄糖基聚合度的短直链淀粉。

淀粉分支酶（SBE）催化α-1-4 糖苷键的断裂，同时将断裂的低聚糖链与α-1-6 糖苷键形成新的分支。SBE 由SBE1、SBEII 组成。SBEI 主要产生DP大于16 的长链淀粉，而SBEII 主要产生DP 小于12的短链淀粉。在单子叶植物中SBEII 存在两种异构体SBEIIa 和SBEIIb。SBEIIa 在植物的所有组织中都有表达，而SBEIIb 在胚乳中特异性表达。降低与支链淀粉合成相关基因SBEIIb 的表达可以增加玉米、小麦胚乳中直链淀粉的含量[14-15]。刘素君等研究表明直链淀粉的含量与抗性淀粉的含量呈显著正相关关系[16-18]。通过RNA 干扰技术抑制水稻中淀粉分支酶SBE1 和SBEII 基因的表达，使得转基因水稻直链淀粉的含量从27.2%提高到64.8%，同时抗性淀粉的含量从0 提高到了14.6%[19]。通过基因编辑的方法抑制OsSBEIIb基因在水稻灌浆期的表达量，降低支链淀粉的含量，使得直链淀粉的含量从19.6%提高到27.4%，促使抗性淀粉的含量从0.2%提高到17.2%[10]。可见，水稻淀粉分支酶OsSBEIIb基因的表达与水稻抗性淀粉的含量密切相关。

研究以湘早籼稻2 号为试验材料，克隆了OsSBEIIb基因的编码序列，并分析了其时空表达特征以及OsSBEIIb基因在不同水稻品种中的变异情况，以期为抗性淀粉水稻育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 水稻材料的种植

试验共35 个水稻品种（见表1），由湖南省水稻研究所种质资源研究室提供。挑选籽粒饱满，大小均匀的种子，于2020 年3 月下旬播种于湖南文理学院生物园，当秧苗长到3 叶一心时移栽到肥力中等的水稻田。移栽后按正常的大田管理措施进行管理，及时清除杂草并进行病虫害的防治。在水稻灌浆时期分别选取正在灌浆的稻穗，液氮速冻后带回实验室备用。

表1 试验所用水稻品种

1.2 水稻OsSBEIIb 基因cDNA 的克隆和测序

以湘早籼2 号灌浆期的水稻胚乳为试验材料，利用RNA 提取试剂盒DP452 提取总RNA 并逆转录成cDNA 作为基因克隆的模板。根据NCBI 网站公布的OsSBEIIb基因序列（LOC4329532），利用Primer Premier 5.0 设计OsSBEIIb基因编码序列克隆引物（表2）。PCR 反应体系：ApexHF HS DNA Polymerase CL（1 U/µL）1 µL，2×ApexHF CL Buffer 25 µL；cDNA 模板2 µL；上游引物1 µL；下游引物1 µL；最后用超纯水补足50 µL。PCR 反应程序：94℃预变性1 min；98℃ 10s；55℃ 16s；68℃ 1 min，共32 个循环。取10 µLPCR 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。然后将PCR 产物切胶、回收，连接T 载体并转化DH5α 感受态细胞，挑取阳性菌落送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.3 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息学分析

利用在线工具（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析OsSBEIIb基因的编码序列；利用在线 程 序（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html） 对OsSBEIIb 蛋白质的分子量和等电点进行预测；利用在线工具NCBI-CDD 数据库预测OsSBEIIb 蛋白质的保守功能域；利用NCBI-BLASTP 序列比对功能对OsSBEIIb 的氨基酸序列进行在线序列比对；DNAMAN 软件用于氨基酸序列一致性的比对；MEGA6.0 软件用于该基因系统进化树的构建。

1.4 水稻OsSBEIIb 基因的时空表达特征分析

在大田水稻长到始穗期时开始取样根、茎、叶、稻穗，此时的稻穗还没有开始灌浆，然后每隔一周取稻穗，并将颖壳和稻粒剥开分离，分别提取总RNA，反转录成cDNA 并作为qRT-PCR 反应的模板，qRTPCR 反应的引物见表2。实时荧光定量PCR 反应体系：QPCR mix 10 µL，模板2 µL，上下游引物各0.8µL，用超纯水补足20 µL。实时荧光定量PCR 反应程序：95℃预变性2 min，95 ℃，15 s；60℃，30 s；共40 个循环。每个反应设置3 个生物学重复，每个生物学重复设置3 个技术重复。

表2 引物名称及其序列

2 结果与分析

2.1 水稻OsSBEIIb 基因的克隆及测序分析

以湘早籼2 号胚乳总RNA 反转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1 所示。从电泳图可以看出，有一条清晰的单一条带，对其切胶回收并送北京擎科生物科技有限公司进行sanger 测序，测序结果表明基因编码序列全长2 478 bp，符合电泳结果。

图1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息学分析

OsSBEIIb基因的编码序列全长2 478 bp，编码一个含有825 个氨基酸的蛋白质（图2），该蛋白的理论分子量为92.85 kD，等电点为5.69。在线工具NCBICDD 数据库预测发现，OsSBEIIb蛋白的保守功能结构域位于69～825 bp 之间，属于1,4-α-淀粉分支酶。

图2 水稻OsSBEIIb 基因的核苷酸和编码的氨基酸序列

在线工具NCBI-BLASTP 对OsSBEIIb的氨基酸序列进行在线序列比对，发现其与粳稻（Oryza sativa JaponicaGroup）、玉 米（Zea mays）、谷 子（Setaria italica）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、高粱（Sorghum bicolor）、黍（Panicum miliaceum）、野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）氨基酸序列的相似性分别为99.88%、85.73%、82.54%、81.53%、81.52%、80.96%、80.36%。这些植物的SBEIIb 氨基酸序列多序列比对（图3）分析发现，湘早籼2 号OsSBEIIb 的氨基酸序列与其他植物SBEIIb 的氨基酸序列一致性为85.96%，表明湘早籼2 号水稻OsSBEIIb 的氨基酸序列总体上是保守的，能够形成稳定的蛋白质结构，行使相似的生物学功能。

图3 OsSBEIIb 氨基酸序列多序列比对

利用MEGA6.0 软件构建OsSBEIIb基因的系统进化树（图4）发现籼早稻2 号与粳稻的亲缘关系最近，与野生二粒小麦的关系最远。这主要原因是籼早稻2 号与粳稻同属于禾本科稻属植物。

图4 水稻OsSBEIIb 与其他植物SBEIIb 的系统进化树

不同颜色氨基酸残基代表不同的一致性。蓝色：氨基酸一致性为100%; 粉红色、青色、黄色分别表示氨基酸的一致性为75%以上、50%以上及33%以上;无颜色标识的氨基酸一致性不足33%。

2.3 水稻OsSBEIIb 基因的时空表达特征分析

2.3.1 水稻OsSBEIIb基因在不同器官的表达特征分别提取水稻根、茎、叶、稻壳和胚乳的总RNA，反转录成cDNA 并作为RT-PCR 的模板。由图5 可知，OsSBEIIb基因在根、茎、叶、稻壳和米粒中都有表达，但是其在米粒中的表达量远大于其在根、茎、叶和稻壳中的表达量，且差异极显著（P＜0.01）。

图5 OsSBEIIb 基因在水稻不同器官的表达

2.3.2OsSBEIIb基因在不同生育期稻壳的表达特征分别提取不同时期稻壳总RNA，然后反转录成cDNA并作为RT-PCR 的模板。由图6 可知，OsSBEIIb基因随着水稻的逐渐成熟，OsSBEIIb基因在稻壳的表达量呈现出了先升高在降低的趋势，但没有显著差异。这种变化趋势的出现可能是剥离的稻壳中有残留的稻米组织，从而引起了该基因表达量的变化。

图6 OsSBEIIb 基因在不同时期稻壳的表达

2.3.3OsSBEIIb基因在水稻不同生育期胚乳的表达特征 分别提取不同时期稻米的总RNA，然后反转录成cDNA 并作为RT-PCR 的模板。由图7 可知，随着稻米的逐渐成熟OsSBEIIb基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，第一周表达量最低，第三周表达量最高，且两者差异达极显著水平（P＜0.01）。因为第一周水稻还没有灌浆，胚乳没有形成，所以OsSBEIIb基因的表达量最低。第三周取样的稻米，此时水稻灌浆最为活跃，因此OsSBEIIb基因的表达量最高。

图7 OsSBEIIb 基因在不同时期稻米的表达

2.4 OsSBEIIb 基因编码区序列分析

利用引物对35 份水稻品种进行PCR 扩增，得到了一条编码序列为2 478 bp 的cDNA 序列，PCR 产物纯化后送北京擎科生物科技有限公司进行sanger 测序。与 “日本晴”OsSBEIIb基因的编码区进行序列比对，在测得的35 个水稻品种OsSBEIIb基因的编码区发现了15 个SNP 变异位点（图8）分别位于117、280、345、586、809、1 029、1 235、1 253、1 326、1 562、1 933、2 132、2 274、2 339、2 340、2 438。这些变异位点都位于OsSBEIIb基因的功能区域。

图8 OsSBEIIb 编码区SNP 变异位点序列

根据15 个SNP 变异位点，可将35 份水稻品种分为9 个单倍型（表3）。由表3 可知，所有单倍型中与“日本晴”差异最小的单倍型是H9、H6，相差1个碱基；与日本晴”差异最大的单倍型是H7，相差7个碱基。频率最高的单倍型是H6 有13 个品种。

表3 OsSBEIIb 基因编码区序列变异位点与单倍型

3 讨 论

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，淀粉是水稻的主要营养成分，而淀粉又分为直链淀粉和支链淀粉。淀粉的合成需要一系列酶的共同参与，不同酶之间相互联系又相互作用。该研究通过PCR 扩增获得了湘早籼2 号水稻淀粉分支酶（OsSBEIIb）基因cDNA 编码区序列，并通过实时荧光定量PCR 技术分析了该基因的时空表达特征。该基因表达具有空间特异性，在根、茎、叶、稻壳的表达量很低，主要在灌浆期稻米的胚乳中表达，在灌浆第3 周表达量最高。可见，OsSBEIIb的表达与水稻支链淀粉的形成密切相关。如果通过RNA 干扰技术或者基因编辑技术抑制该基因在灌浆期的表达，那么水稻支链淀粉的含量可能会大幅下降，而直连淀粉的含量将会大幅增加，这样水稻抗性淀粉的含量会得到一定的提升。

通过PCR 扩增，sanger 测序获得了35 个水稻品种OsSBEIIb基因的编码区序列。通过序列多态性分析发现，该基因在不同水稻品种中存在着SNP 位点变异，且变异位点都位于该基因的功能编码区，表明该基因在不同水稻品种中存在着丰富的多态性信息。这些丰富的变异位点为抗性淀粉水稻品种的选育提供了丰富的基因资源，为高抗性淀粉水稻品种的选育提供了丰富的物质基础。