中华蜜蜂磁响应基因MagR、Cry2的克隆和时空表达

李英娇, 周 贺, 陈艺杰, 李江红

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002；2.农业农村部(福建)蜜蜂生物学观测站，福建 福州 350011)

蜜蜂是自然生态链中不可或缺的重要一环.在蜜蜂的生活环境中，它们不得不面对许多包括磁场、杀虫剂、疾病、天敌、气候变化等诸多胁迫因子影响.研究表明[1-7]，磁场影响着蜜蜂的行为、生理和生长发育等方面.蜜蜂体内有磁感应受体，但其作用机制还不明确.生物对磁场感知的关键在于“磁受体”的确定，目前主要有两种假说得到了广泛认可，即基于磁铁矿颗粒(Fe3O4)的磁受体假说和依赖于隐花色素的化学自由基对假说.前者认为，生物可借助体内的磁铁矿颗粒(Fe3O4)感受磁场[8].目前得到公认的、最有可能存在该类磁受体部位有鸟的上喙和内耳、鱼的鼻组织以及昆虫的腹部.其中蜜蜂前腹的背侧区被认为是磁受体可能存在的解剖位点之一[9].而后者则认为生物体内的隐花色素(cryptochrome, Cry)是理想的磁受体，Cry在蓝光/近紫外光等光刺激下容易发生电子转移，产生自由基对(2个不成对电子)，这个自由基对的自旋状态能够受磁场影响，在单重态和三重态之间快速转换，从而引发下游的神经信号传导，使生物在第一时间感受到变化的磁场信息，指导动物精确定位、定向[10-11].

实际上，基于磁铁矿颗粒和隐花色素的两种磁感应机制之间并不冲突，少数生物的磁感应仅涉及其中一种，而大多数则是两者兼具，互为补充；两种磁受体同时感应磁场，同时将来自太阳、星空和地标等视觉信息进行整合，使生物辨别方向的准确率显著提高.此外，另一种潜在的磁受体，即MagR(Magnetoreceptor)，原名IscA，属于铁硫簇结合蛋白(简称铁硫蛋白)[12]，该蛋白由Jacobson et al[13]首次在棕色固氮菌中发现，命名为ORF6.随着测序技术的进步，经过PCR测序等手段进行验证后，将ORF6改名为IscA[14].之后，Long et al[15]研究表明，将IscA1导入到HEK-293细胞及秀丽隐杆线虫中，发现外加磁场会改变细胞的动作电位和线虫的运动，并将IscA命名为MAR.也有研究人员在果蝇全基因组中筛选到全新的磁受体蛋白，并最终将其命名为MagR[16].MagR蛋白是线粒体内一类重要的功能蛋白，不仅自身能够感应磁场，也能与Cry相互作用形成光磁耦合的磁场感应复合物.在大肠杆菌、帝王蝶、鸽子和人等多种生物中均已证实MagR能与Cry在体外形成稳定的蛋白复合物[16].目前MagR基因在果蝇、粘虫、褐飞虱等昆虫上均有报道，而在蜜蜂领域的研究较少.隐花色素Cry对蓝光、近紫外光较敏感，在长期进化过程中，Cry产生了两大基因家族，即Cry1和Cry2，果蝇体内只有Cry1，而蜜蜂体内只有Cry2[17].目前在果蝇、褐飞虱等昆虫上有较多关于Cry的报道[16,18-22]，而在蜜蜂领域的研究较少.赵方媛等[23]成功克隆了西方蜜蜂MagR基因序列，但MagR基因是否通过编码的蛋白作为磁受体在蜜蜂的定位导航中发挥作用，目前尚不清楚.另外，MagR和Cry2蛋白能够形成复合体，其蛋白结构具有特殊的结构域使两者有机地结合在一起[16].因此，本试验通过对中蜂磁响应基因AcMagR和AcCry2进行克隆和测序，分析相关基因序列信息，对编码蛋白的结构特征进行预测，利用qPCR技术对这两个基因在工蜂不同日龄、不同组织中的表达特征进行分析，以期为磁响应基因MagR和Cry2的功能及磁感应机理研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 中华蜜蜂样本来自农业农村部(福建)蜜蜂生物学观测站内自养蜂群.基因克隆样本：在蜂箱内随机抓取10只工蜂，液氮速冻后置于-80 ℃储存备用.荧光定量PCR的样本：选取6群群势强壮、无自然分蜂倾向的中华蜜蜂健康蜂群，分别从蜂巢中抽出1～2张新蜂即将大量出房的封盖子脾置于人工培养箱中恒温恒湿培养(相对温度34.5 ℃，相对湿度60% RH，避光培养)，待其羽化出房后用油漆笔在背部进行标记，再放回原来的蜂群，分别在成蜂1、5、10、15、20、25、30日龄时进行采样.每个日龄均采90只，随机分为3组，每组30只，并用镊子取下各日龄工蜂的头、胸、腹(去除消化系统)，迅速投入液氮速冻后置于-80 ℃储存备用.

1.1.2 试剂 Trizol RNA分离试剂，Ambion公司；氯仿，北京化工厂；酚，Coolaber公司；反转录试剂盒，PCR试剂盒，Takara公司；荧光定量PCR试剂盒Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)，上海翊圣公司；胶回收试剂盒，AXYGEN公司；Primer Mix，天根生物科技有限公司.

1.1.3 仪器 高压灭菌锅(SS-325，日本TOMY公司)、Venticell 55升标准型干燥箱(MC000712，德国MMM公司)、低温离心机(5424-R，德国Eppendoff公司)、移液枪(德国Eppendoff公司)、大型低温离心机(Centrifuge 5145D，德国Eppendoff公司)、电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、超纯水器(E1IX10，美国Millipore公司)、PCR 扩增仪(PTC-200，Takara公司)、凝胶成像系统(Gel Doc2000，美国Bio-Rad公司)、超低温冰箱(FORMA，美国Thermo Electron公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、荧光定量PCR仪(QuantStudio 6 Flex，美国ABI公司).

1.2 方法

1.2.1 提取总RNA与合成cDNA 用研磨器对不同日龄、不同组织的工蜂样品充分研磨，参照 RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA.1%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA质量，紫外分光光度计测量总RNA浓度，参照反转录试剂盒说明书步骤，以1 μg总RNA量反转录合成第1条cDNA 链，存于-20 ℃备用.

1.2.2 引物设计与目的基因克隆 以前期实验室转录组结果为基础，引物使用Primer Premier 6.0进行设计，引物合成委托福州尚亚生物技术有限公司完成(表1).按照陈艺杰等[24]的反应体系和程序进行PCR扩增，MagR和Cry2退火温度分别设定58、55 ℃.电泳检测并于紫外灯下切取目的条带回收纯化，用pGM-T载体连接过夜，转至DH5α感受态细胞，平板培养过夜.最后，挑取单克隆菌落PCR鉴定为阳性后扩大培养，菌液送福州博尚生物技术有限公司测序.

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.3 基因的序列分析 采用NCBI BlastP同源性分析；利用ORF Finder软件获得该序列的编码区域；SMART分析功能结构域；使用MEGA 6.0软件邻位相连法(Neighbor-joining)进行1 000次重复计算后构建系统进化树，MagR、Cry蛋白序列来源见表2.

表2 中蜂与其他昆虫MagR、Cry蛋白序列来源Table 2 Sequence information of MagR and Cry proteins used in phylogenetic analysis

1.2.4 荧光定量PCR反应 以β-actin作为参照基因，荧光定量PCR反应体系(10 μL)：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.25 μL，cDNA模板0.5 μL，DEPC水4 μL.反应条件：UDG激活50 ℃ 2 min，预变性95 ℃ 3 min；PCR扩增(40个循坏)95 ℃ 30 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 45 s；溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s.定量分析设置3个生物学重复和3个技术重复.

1.2.5 数据处理与分析 根据荧光定量PCR得到的标准曲线及荧光曲线的Ct值，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，分别采用SPSS 21.0软件中的单因素方差分析(ANOVA)和t-检验进行显著性差异分析.所得结果均以平均数±标准误(Mean±SE)表示，并利用GraphPad Prism 8.0软件进行图形分析.P<0.05 作为具有显著性差异的标准.

2 结果与分析

2.1 目的基因克隆

利用设计的引物，以中华蜜蜂cDNA为模板进行PCR 扩增，将产物进行电泳检测，得到与预期长度一致的目的片段，AcMagR和AcCry2分别约为500、1 700 bp(图1).

图1 AcMagR和Accry2基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR products of AcMagR and Accry2 genes

2.2 序列分析

利用NCBI BlastP分析测序所得的序列同源性，将目的基因分别命名为AcMagR和AcCry2，并提交至GenBank数据库，获得的登录号分别为：MZ054257、MZ054258.利用ORF Finder对所获得的序列分析表明，2个目的基因的完整开放阅读框(ORF)分别为393、1 713 bp，分别编码130、570个氨基酸.氨基酸序列中分别含有4和13个保守的半胱氨酸位点，AcMagR蛋白具有Fe-S_biosyn功能结构域，位于第24～126位氨基酸之间.AcCry2蛋白具有2个功能结构域(DNA_photolyase和FAD_binding_7)，分别位于第23～189、303～503位氨基酸之间.

2.3 系统进化树分析

将克隆所得核酸序列在NCBI核酸数据库中进行Blastp分析，找到与目的基因(AcMagR和AcCry2)有同源性的昆虫氨基酸序列，用MEGA6.0软件构建系统进化树(图2).结果表明，中华蜜蜂MagR基因与西方蜜蜂亲缘关系最近，与大蜜蜂、小蜜蜂、黑大蜜蜂、欧洲熊蜂等亲缘关系较近，与北方皱切叶蚁、红收获蚁亲缘关系较远，与西花蓟马、黑腹果蝇、铜绿蝇、丝光绿蝇亲缘关系最远；而中华蜜蜂Cry2基因与西方蜜蜂的亲缘关系最近，与大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂等亲缘关系较近，与佛罗里达弓背蚁、北方皱切叶蚁、红收获蚁等亲缘关系较远.

A:MagR；B：Cry2.图2 基于MagR和Cry2蛋白序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed by MagR and Cry2 proteins

2.4 AcMagR和AcCry2基因表达分析

实时荧光定量PCR结果表明，在同日龄工蜂中，胸部AcMagR基因的表达量显著高于头部和腹部，头部和腹部之间差异不显著，AcMagR基因在20日龄后的工蜂体内表达量显著高于前期日龄工蜂，胸部AcCry2的表达量也显著高于头部和腹部，头部和腹部两者比较差异不显著，但AcCry2基因在所有日龄工蜂体内表达量均较高(图3).

A:AcMagR；B：AcCry2.柱上不同的小写字母代表同一日龄不同组织的表达量差异显著.图3 中蜂不同日龄工蜂头部、胸部和腹部中AcMagR、AcCry2的相对表达量Fig.3 Relative expression level of AcMagR and AcCry2 in head, thorax and abdomen of A.cerana workers bee at different ages

3 结论

本试验获得中蜂AcMagR、AcCry2基因序列，分别含有长为393、1 713 bp的完整开放阅读框(ORF)，编码130、570个氨基酸.系统进化树分析表明，中华蜜蜂的MagR基因与西方蜜蜂亲缘关系最近，与大蜜蜂、小蜜蜂、黑大蜜蜂等亲缘关系较近，而与果蝇、绿蝇等其他昆虫的亲缘关系较远，这与这些昆虫之间的亲缘关系基本一致.MagR蛋白具有多个铁硫簇结合位点，而铁硫簇是形成磁感应复合体magnetoreceptor的关键物质，说明MagR可能与磁感应有关[25].已有研究证明[26]，在果蝇中MagR蛋白聚合形成棍状的形似指南针的结构，能够感受外界磁场的变化；AcCry2蛋白具有DNA光解酶结构域(DNA_photolyase)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD_binding_7)结合区域，这两个结构域均属于Cry蛋白的发色团，在光信号接收和传导方面是重要功能元件，说明Cry2需要结合在DNA上发挥作用，光诱导的Cry蛋白的FAD-色氨酸自由基对具有磁敏感特征，可以感应地磁场.这说明AcMagR、AcCry2基因可能在蜜蜂的磁场感受中发挥重要作用.

AcMagR基因在胸部的表达量显著高于头部和腹部，与赵方媛等[23]在西方蜜蜂试验中所得结果一致.胸部是蜜蜂的运动中心，在蜜蜂飞行过程中起着至关重要的作用.在正常蜂群中，出房1周后的成年工蜂，主要从事巢内相关哺育任务(哺育蜂)，1～2周后，它们则从事巢内清理、保卫或储蜜酿蜜等工作，出房3周以后开始外出从事采粉采蜜等工作(采集蜂)[27].研究表明[4,28-30]，在外磁场干扰下，采集蜂容易受到影响，如舞蹈行为、定向能力易受干扰，返巢数减少，学习能力、记忆力下降，导致飞行和觅食行为均受影响，进而降低授粉能力.因此，AcMagR基因在20日龄后采集蜂胸部高表达，可能与蜜蜂外出采集、返巢过程中的定位有关系；AcCry2基因在不同日龄工蜂的胸部表达量高于头部和腹部，高表达部位上与黏虫、鸽子等一致[16,31].AcMagR和AcCry2共同高表达于采集蜂的胸部，这为蜜蜂形成类似于果蝇体内的棒状磁感应复合体提供了基础，暗示它们在工蜂定位、归巢中发挥重要作用[16].由于MagR和Cry2基因及其蛋白在蜜蜂领域的研究较少，从基因层面对蜜蜂定向机制的研究存在一定的局限性，不能完全确定MagR和Cry2基因在蜜蜂体内的具体功能，未来还需要研究蜜蜂行为学、神经生物学、蛋白组学等，以解开蜜蜂的磁感应之谜.