二补助育汤对胚胎着床障碍小鼠子宫血管生成相关因子表达的影响

周雨玫 刘雁峰 申萌萌

摘要 目的：探讨二补助育汤对胚胎着床障碍模型小鼠子宫内膜形态及血管生成素-1（Ang-1）mRNA、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达和定位的影响。方法：24只ICR雌性小鼠随机分为空白组、模型组、戊酸雌二醇组、二补助育汤组，每组6只，用米非司酮建立胚胎着床障碍动物模型，各组给予相应药物灌胃，妊娠第5天处死小鼠后，检测各组妊娠率、平均着床位点数、子宫内膜Ang-1和VEGF mRNA表达量及其蛋白定位。结果：模型组小鼠平均胚胎着床位点数、Ang-1 mRNA、VEGF mRNA表达量明显低于空白组（均 P <0.05）;与模型组比较，二补助育汤组平均胚胎着床位点数、Ang-1 mRNA、VEGF mRNA表达量显著提高（均 P <0.05）。结论：二补助育汤可提高子宫内膜Ang-1和VEGF蛋白表达量，促进子宫内膜血管生成，從而提高子宫内膜容受性。

关键词 二补助育汤;胚胎着床障碍小鼠;血管生成;血管生成素-1;血管内皮生长因子;子宫内膜容受性;妊娠率;平均胚胎着床位点数

Influence of Erbu Zhuyu Decoction on the Expression of Uterine Angiogenesis-related Factors in the Endometrium of Mice with Embryo Implantation Dysfunction

ZHOU Yumei1，LIU Yanfeng1，SHEN Mengmeng2

（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China）

AbstractObjective： To investigate the influence of Erbu Zhuyu Decoction on the expression of angiopoietin-1（Ang-1） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction. Methods： Female ICR mice（n=24） were randomly assigned into a blank group，a model group，an Erbu Zhuyu Decoction group，and a progynova group（each n=6）.Mifepristone was used to establish the model of embryo implantation dysfunction.The mice in different groups were orally administrated with corresponding agents each day and sacrificed in the afternoon of the 5th day of pregnancy.The morphology of uterus was observed，and the pregnancy rate and average number of embryo implantation sites were calculated.The mRNA levels and protein localization of Ang-1 and VEGF were determined. Results： Compared with the blank group，the modeling decreased the embryo implantation sites（ P <0.05） and down-regulated the mRNA levels of Ang-1 and VEGF（ P <0.05）.Compared with the model group，Erbu Zhuyu Decoction increased the embryo implantation sites（ P <0.05） and up-regulated the mRNA levels of Ang-1 and VEGF（ P <0.05）. Conclusion： Erbu Zhuyu Decoction can up-regulate the mRNA levels of Ang-1 and VEGF to improve the blood supply and promote the receptivity of endometrium，thereby facilitating embryo implantation.

Keywords Erbu Zhuyu Decoction; Mouse model of embryo implantation dysfunction; Angiogenesis; Angiopoietin-1; Vascular endothelial growth factor; Endometrial receptivity; Pregnancy rate; Average number of embryo implantation sites

中图分类号：R243;R271.14 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.013132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

子宫内膜容受性（Endometrial Receptivity，ER）是指子宫内膜在特定时期对胚胎表达出接受着床的状态[1]。胚胎着床需要充足的血管生长和维持，过程中伴随子宫内膜组织生成丰富的血管[2]，以提供营养支持。充足的子宫血管和调节细胞因子是胚胎成功着床的必要条件，子宫内膜血管生成和细胞因子表达的下降会导致生殖失败[3]。血管生成主要受两大关键生长因子家族调节：血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）家族和血管生成素（Angiopoietin，Ang）家族[4]，两家族共同合作诱导血管的生长[5]。研究表明，Ang-1和VEGF在种植窗期子宫组织及早期胎盘中出现高表达，提示Ang-1和VEGF可能参与胚胎植入过程[6]。故调控血管生成的Ang、VEGF家族可能影响子宫内膜容受性。二补助育汤是北京中医药大学东直门医院名老中医肖承悰教授治疗子宫内膜容受性不良的经验用方，可明显提高子宫内膜容受性不良患者体外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization Embryo Transfer，IVF-ET）的成功率[7]。本实验在前期研究的基础上，试从血管生成角度出发，探讨二补助育汤对血管生成相关基因Ang-1和VEGF的影响，进一步研究其改善子宫内膜容受性的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物6～8周龄未交配过无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级ICR雌性小鼠24只，体质量（25±2）g;7～9周龄有生育能力SPF级ICR雄性小鼠12只，体质量（25±2）g，购自北京维通利华实验技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有动物由北京中医药大学动物房负责饲养，自由获取食物和饮水，饲养环境温度为（22±2）℃，湿度为5% ～10%，光照周期12 h/12 h。本研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（伦理审批号：BUCM-4-2020110203-4105）。

1.1.2药物二补助育方由骨碎补15 g、补骨脂15 g、巴戟天15 g、桑寄生15 g、川续断15 g、川牛膝15 g等药物组成，由北京康仁堂药业有限公司制作出颗粒制剂。用0.5%羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl Cellulose，CMC）溶液加热搅拌溶解，制成质量浓度为3 g/mL的混悬液;戊酸雌二醇（Bayer公司，德国，进口药品注册证号：H20160679，批号：502A）。取1.5 mg放在研钵中研碎，溶于0.5% CMC溶液中，搅拌均匀，制成浓度为0.03 mg/mL溶液;米非司酮片（华润紫竹药业有限公司，批号：43190503）研碎后药末溶于麻油中配制成质量浓度为0.68 g/mL的米非司酮油剂。

1.1.3试剂与仪器4%多聚甲醛（SPI公司，英国，货号：#2615）;anti-VEGF（北京中杉金桥公司，货号：ZA-509）;Ang-1 Polyclonal Antibody（Abbkine公司，美国，货号：ABP53096）;兔超敏即用型二步法<非生物素>检测试剂盒[北京中杉金桥公司，货号：PV-9001（GBI）];SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix熒光定量PCR（Bio-Rad公司，美国，货号：Cat#A5000）。荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国，型号：CFX96）;光学显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：Olympus BX60）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备所有小鼠适应性饲养1周后，每日16：00时合笼，雌雄比例2∶ 1，次日8：00发现阴栓者认定为妊娠，记为妊娠第1天。将妊娠小鼠按照随机数字表分为4组：空白组、模型组、戊酸雌二醇组、二补助育汤组，每组6只。分别予以相应药物灌胃。妊娠第4天9：00，模型组、戊酸雌二醇组、二补助育汤组于小鼠后颈部皮下注射米非司酮油剂，注射量为0.1 mL/只，制成胚胎着床障碍模型;空白组同时间注射麻油，注射量为0.1 mL/只。

1.2.2给药方法空白组和模型组小鼠于妊娠第1天开始每天灌服0.5% CMC溶液，其余各组灌服相应药物（二补助育汤组、戊酸雌二醇组小鼠给药量分别相当于临床体质量70 kg的成人每日剂量160 g、2 mg）灌胃量按0.1 mL/10 g计算，连续灌胃5 d。各组小鼠于妊娠第5天下午脱颈处死，无菌条件下快速摘取子宫，其中一角子宫迅速放入冻存管中液氮中冷冻，-80 ℃保存，备PCR检测;另一角子宫投入4%多聚甲醛溶液中固定，备苏木精-伊红（Hematoxylin Eosin，HE）染色及免疫组织化学检测。

1.2.3检测指标与方法1）观察各组小鼠子宫大体形态;2）妊娠率及平均着床位点数：记录各组小鼠妊娠数量及每只小鼠着床位点数。妊娠率（%）=妊娠小鼠数/该组雌鼠数×100%;平均着床位点数（%）=总胚泡数/该组妊娠小鼠数×100%;3）光镜下子宫内膜形态：采用HE染色法，观察子宫组织的形态结构。操作步骤如下：石蜡包埋，4 μm厚切片，脱蜡，冲洗5 min，苏木精染色15 min，水洗，5%伊红染色5 min，冲洗5 min，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片;4）免疫组织化学法检测各组小鼠子宫内膜中Ang-1、VEGF的表达：4%多聚甲醛固定24 h后进行病理制片，乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、4 μm厚切片，常规脱蜡至水，3% H2O2 10 min，抗原修复10 min，一抗4 ℃过夜，二抗、三抗37 ℃ 30 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、二甲苯透明、树脂胶封固，显微镜观察;5）子宫内膜Ang-1、VEGF mRNA的表达：取各组小鼠子宫内膜组织100 mg，Trizol法提取总RNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测RNA完整性，反转录为cDNA后，进行RT-PCR，内参为GAPDH。Ang-1：上游引物5′-CAGCATCCTGCAGAAGCAAC-3′，下游引物5′-TCTCTTTTTCCTCCCTTTAGCA-3′，扩增片段99 bp;VEGF：上游引物5′-TATTCAGCGGACTCACCAGC-3′，下游引物5′-CCTCCTCAAACCGTTGGCA-3′，扩增片段150 bp。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。基因表达量采用相对定量2-△△Ct法进行计算。132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

1.3统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（  ±s ）表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析，两两比较采用LSD法。不满足正态分布或方差齐性，用非参数检验。以 P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1子宫形态空白组小鼠子宫颜色淡红，胚胎着床处子宫膨大，呈串珠状改变，血管丰富;模型组小鼠子宫颜色苍白，管腔较细，胚胎着床数目极少，分布稀疏，着床处膨大较空白组小，血管稀疏;戊酸雌二醇组小鼠子宫颜色黄白，管腔形态短粗，胚胎着床数目少，分布稀疏且不均匀;二补助育汤组小鼠子宫颜色淡红，管腔细长，胚胎着床数目较多，分布均匀呈串珠状改变，血管丰富。见图1。

2.2妊娠率及平均着床位点数与空白组比较，模型组平均胚胎着床位点数减少，差异有统计学意义（ P <0.05），胚胎着床障碍模型造模成功;与模型组比较，二补助育汤组与戊酸雌二醇组平均着床位点数明显增多，差异有统计学意义（均 P <0.05）;与戊酸雌二醇组比较，二补助育汤组平均着床位点数略有增多，差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1，图2～3。

2.3子宫内膜HE染色空白组子宫内膜腔上皮增厚，呈假复层改变;子宫间质稀疏，呈蜕膜化表现;腺体、血管丰富。模型组子宫内膜厚度变薄，腺体、血管数量较空白组减少。戊酸雌二醇组子宫内膜较模型组有明显改善，腺体表达丰富，但血管较少。二补助育汤组子宫内膜较模型组增厚，间质内腺体、血管表达丰富。见图4。

2.4子宫内膜Ang-1蛋白定位及mRNA表达

空白组Ang-1蛋白在子宫内膜间质、血管上皮细胞中表达阳性。模型组VEGF蛋白在子宫内膜血管上皮细胞上表达弱阳性，在间质细胞上表达阴性。戊酸雌二醇组和二补助育汤组Ang-1蛋白定位与空白组相接近。见图5。

与空白组比较，模型组小鼠子宫内膜Ang-1 mRNA表达量减少（ P <0.05）;与模型组比较，戊酸雌二醇组和二补助育汤组小鼠子宫内膜Ang-1 mRNA表达量均升高，且差异均有统计学意义（均 P <0.05）。见表2，图6。

2.5子宫内膜VEGF蛋白定位及mRNA表达

空白组VEGF蛋白在子宫内膜腔上皮、血管上皮、腺体上皮、间质细胞上阳性表达。模型组VEGF蛋白在子宫内膜腔上皮、血管上皮、腺体上皮细胞上表达弱阳性，在间质细胞上表达阴性。戊酸雌二醇组和二补助育汤组VEGF蛋白定位与空白组相接近。见图7。

与空白组比较，模型组小鼠子宫内膜VEGF mRNA表达量减少（ P <0.05）;与模型组比较，戊酸雌二醇组和二补助育汤组小鼠子宫内膜VEGF mRNA表达量均升高，且差异均有统计学意义（均 P <0.05）。见表3，图8。

3讨论

北京中医药大学东直门医院肖承悰教授治疗子宫内膜容受性不良選用经验方二补助育汤加减。肖教授认为肾虚血瘀、心血不足、胞脉不畅为该病的主要病机，立“补肾气、通胞脉”治法，临床疗效显著。方由骨碎补、补骨脂、巴戟天、桑寄生、川续断、川牛膝等药物组成，方名中“二补”为君药骨碎补、补骨脂，二药合用补肾助孕，温阳活血;巴戟天补肾益精，助君药补肾助阳;桑寄生、川续断补肾益精，活血通脉，温而不燥，补而不腻;川牛膝补肾气、通血脉，引诸药下行于胞中。方中补肾药物与活血行气药物灵活配伍，补而不滞，共奏补肾、温阳、活血、通脉之功。团队前期临床研究表明，二补助育汤能改善患者临床症状，提高再次IVF-ET的成功率及临床妊娠率，可从增加子宫内膜厚度、降低子宫动脉及内膜血流值、提高Salle评分、纠正母体血栓前状态等方面提高子宫内膜容受性[7-9]。前期实验研究表明，该方可通过改善子宫内膜胞饮突表达、提高子宫内膜雌激素受体、孕激素受体、白细胞抑制因子、整合素ανβ3、干细胞因子mRNA、HOXA-10 mRNA的表达、激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase-Protein Kinase B，PI3K/AKT）/内皮型一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）通路、增加自噬相关标志物Beclin-1、LC3B的表达来改善子宫内膜容受性[10-15]。

米非司酮和吲哚美辛是目前研究较成熟的胚胎着床障碍动物模型建立用药。米非司酮是一种孕激素拮抗剂，具有抗早孕作用，其机制是与孕激素受体竞争性结合从而达到抗孕酮的效果。米非司酮可引起前列腺素（Prosglandins，PGs）大量释放、抑制黄体生成素分泌、从而导致流产、抗排卵及胚胎着床[16]。研究表明，米非司酮可抑制子宫内膜Ang-1、VEGF的表达，阻碍子宫内膜血管正常生成，造成子宫内膜容受性降低[17]。吲哚美辛可通过抑制PGs合成酶环氧合酶（Cyclooxygenase，COX）的表达，降低PGs的含量，阻碍VEGF的表达，使子宫内膜血管生成受到抑制，血管通透性降低，子宫内膜不能正常蜕膜化，达到阻碍胚胎着床的作用[18]。米非司酮和吲哚美辛虽都具有抗着床效应，都能够复制稳定的胚胎着床障碍模型，但吲哚美辛具有强烈的抗炎作用，对全身其他系统都有不良影响，易造成动物损伤甚至死亡，而米非司酮未表达出对其他各系统有明显不良反应，且具有给药次数少、剂量小的优点，故本研究选用米非司酮建立胚胎着床障碍动物模型。一般情况下，发育正常的小鼠胚胎在母鼠妊娠第4天到达宫腔，在子宫内膜着床的时间约为妊娠第4.5天[19]。据此，本研究于小鼠妊娠第4天颈部皮下注射米非司酮油剂，通过抑制子宫内膜血管生成，造成胚胎着床障碍模型[20]。戊酸雌二醇常作为在IVF-ET周期中雌激素补充治疗用药，可修复受损的子宫内膜，提高移植后的子宫内膜容受性[21]，故本研究选用戊酸雌二醇作为阳性对照药物。132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

维持子宫内膜发育、支持胚胎着床常伴有内膜血管的生长和消退，故血管生成已成为评价子宫内膜容受性的重要参考依据[22]。近年来发现Ang家族成员之一Ang-1参与调节血管生成及其稳定性。研究表明，Ang-1基因在胚胎着床时期的子宫内膜中过表达，参与着床部位的血管新生与重塑，对囊胚成功着床有重要意义[23]。VEGF参与血管生成，影响血管通透性，可促进新生血管的发生和生长，有助于胚胎早期绒毛血管的形成，利于胚胎着床。围着床期VEGF的过表达可促使子宫内膜容受性增加[24]。VEGF和Ang保持动态平衡，VEGF促使血管内皮细胞分裂增殖，加快血管生成;血管生成后，Ang可增强新生血管稳定性，其中Ang-1在血管生成后期通过降低血管通透性，增加新生血管稳定性[25-26]。而Ang-1还可与VEGF共同抑制血管内皮细胞凋亡，降低血管通透性，抑制炎症反应，联合作用保护血管[27]。

本研究通过检测子宫内膜组织中Ang-1 mRNA与VEGF mRNA的表达，评估小鼠子宫内膜血管生成水平。实验结果表明，米非司酮可造成小鼠子宫内膜变薄，抑制子宫内膜Ang-1 mRNA与VEGF mRNA表达，导致小鼠子宫内膜血管生成障碍，容受性下降，妊娠率及平均着床位点数降低。Ang-1 mRNA与VEGF mRNA主要在子宫内膜血管上皮细胞及血管周围的间质细胞中表达，戊酸雌二醇和二补助育汤能够提高二者的表达水平，提示二补助育汤可通过促进子宫内膜血管生成提高子宫内膜容受性。

综上所述，二补助育汤能够提高子宫内膜Ang-1 mRNA、VEGF mRNA的表达，提高妊娠率，增加胚胎着床位点数，其机制可能是通过促进子宫内膜血管生成，改善胚胎着床处血供，从而提高子宫内膜容受性。

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（2021-03-30收稿本文编辑：杨燕）

基金项目：国家自然科学基金项目（82074480）作者简介：周雨玫（1993.04—），女，博士研究生在读，研究方向：中医药防治女性生殖内分泌紊乱疾病、不孕症等，E-mail：zhouyumeibucm@163.com通信作者：刘雁峰（1963.02—），女，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药防治女性生殖内分泌紊乱疾病、不孕症等，E-mail：liuyaf8888@sina.com132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F