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玉米芯低聚木糖制备方法对比研究

2022-06-05孙军涛张智超薛文龙周润浩王怡馨王怡卓

中国调味品 2022年6期
关键词:酶法木糖玉米芯

孙军涛,张智超,薛文龙,周润浩,王怡馨,王怡卓

(许昌学院,河南 许昌 461000)

低聚木糖是由2~9个木糖单元,以β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖混合物[1]。低聚木糖具有较高的耐热和耐酸性能,在pH 2.5~8.0范围内100 ℃加热1 h几乎不分解,是双歧杆菌增殖所需用量最小的低聚糖[2],具有改善人体肠道、抗龋齿、提高免疫机能、促进钙的吸收、改善脂质代谢等功能[3-6]。

玉米芯是制备低聚木糖的主要原材料之一[7],2020年我国玉米总产量约2.76亿吨,大约有0.88亿吨的玉米芯副产物,为低聚木糖的制备提供了丰富的原料资源。目前低聚木糖的制备方法主要包括两种:一种是采用酸解法、蒸煮法和微波法等直接将木质纤维素降解为低聚木糖;另一种方法是预处理-酶解法制备低聚木糖,其中预处理方法有酸水解法、碱水解法、水热法、有机溶剂法、超声波辅助法和微波辅助法等[8-9]。文章以玉米芯为原料,采用复合酶法、超声波辅助复合酶法、碱-酶法、高温蒸煮-酸法、碱-超声波辅助酶法和酸-复合酶法制备低聚木糖,分别对6种方法玉米芯组织结构变化和低聚木糖组分进行对比分析,为用玉米芯制备功能性低聚木糖提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

玉米芯:河南省许昌市;纤维素酶、木聚糖酶:江苏锐阳生物科技有限公司;3,5-二硝基水杨酸:国药集团化学试剂有限公司;木糖、木二糖、木三糖、木四糖:上海甄准生物科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

EVO LS15型扫描电子显微镜 英国蔡司公司;FA1004B型分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司;T6型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;NLD-6DI型超微粉碎机 济南纳力德超微粉碎技术公司;1260 Infinity高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;KQ-250E型超声波清洗器 上海迈坤化工有限公司;LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 测定方法

1.2.1.1 还原糖

还原糖的测定采用DNS法[10]。

1.2.1.2 可溶性总糖

向待测液中加入终浓度为72 g/L的浓硫酸,沸水浴2 h,中和至中性,按还原糖的测定方法测定待测液中可溶性总糖的含量。

1.2.1.3 聚合度

1.2.2 玉米芯低聚木糖的制备

1.2.2.1 复合酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸馏水,调pH至5.0,加入1.5%的复合酶(木聚糖酶与纤维素酶按照2∶1的比例混合),混匀后,在50 ℃下水浴酶解1 h制备低聚木糖。

1.2.2.2 超声波辅助复合酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸馏水,调pH至5.0,加入玉米芯质量1%的复合酶(木聚糖酶与纤维素酶按照3∶2的比例混合),混匀后,在温度55 ℃、超声功率250 W下超声波辅助酶解20 min制备低聚木糖[11-12]。

1.2.2.3 碱-酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶25(g/mL)的比例加入1 mol/L的氢氧化钠,置于110 ℃高压灭菌锅中处理40 min,冷却至室温后调pH至5.0,再加入玉米芯质量6%的木聚糖酶,在55 ℃下水浴加热50 min制备低聚木糖[13]。

1.2.2.4 高温蒸煮-酸法

按照料液比1∶20(g/mL)加1.4 mol/L的硫酸于玉米芯中,置于110 ℃高压灭菌锅中处理50 min,冷却后的溶液即为低聚木糖粗液。

1.2.2.5 碱-超声波辅助酶法

按照料液比1∶20(g/mL)加15%氢氧化钠溶液于玉米芯中,置于100 ℃高压灭菌锅中处理2 h, 冷却至室温后调pH至5.0,再加入6%的木聚糖酶,在温度55 ℃和超声功率250 W下超声波辅助酶解10 min[14]。

1.2.2.6 酸-复合酶法

按照料液比1∶6(g/mL)加2.5 g/L的硫酸于玉米芯中,置于120 ℃高压灭菌锅中处理60 min,冷却后调pH至5.0,加入玉米芯质量1.5%的复合酶(由木聚糖酶与纤维素酶按照2∶3的比例混合),50 ℃下酶解30 min。

1.2.3 玉米芯低聚木糖溶液中糖含量分析

分别对复合酶法、超声波辅助复合酶法、碱-酶法、高温蒸煮-酸法、碱-超声波辅助酶法和酸-复合酶法制备的低聚木糖溶液中还原糖、可溶性总糖、聚合度进行测定。

1.2.4 玉米芯组织结构扫描电镜分析

采用扫描电子显微镜分别对粉碎后的玉米芯、不同制备方法玉米芯残渣的微观结构进行分析,研究不同处理条件下玉米芯表面形态变化。

1.2.5 玉米芯低聚木糖组分分析

1.2.5.1 薄层层析

层析板为硅胶板,展开剂为乙腈和水(体积比为85∶15),显色剂为甲醇和5%硫酸(体积比为95∶5),对不同方法制备的低聚木糖组分进行定性分析[15]。

1.2.5.2 高效液相色谱分析

色谱柱为Hi-Plex Na(300 mm×7.7 mm, 10 μm),流动相为水,流速为0.3 mL/min,柱温85 ℃。分别对不同方法制备的玉米芯低聚木糖组分进行定量分析[16]。

2 结果与分析

2.1 玉米芯水解液中还原糖、可溶性总糖和聚合度分析

复合酶法、超声波辅助复合酶法、碱-酶法、高温蒸煮-酸法、碱-超声波辅助酶法和酸-复合酶法制备低聚木糖溶液中还原糖含量、可溶性总糖含量和聚合度见表1。

表1 玉米芯水解液还原糖含量、总糖含量和聚合度分析Table 1 Analysis of reducing sugar content, total sugar content and polymerization degree of corncob hydrolysate

由表1可知,高温蒸煮-酸法、碱-酶法和酸-复合酶法制备的低聚木糖溶液中还原糖含量(以玉米芯质量计)较高,分别为369.95,206.11,199.14 mg/g,超声波辅助复合酶法制备的低聚木糖溶液中还原糖含量最低,为75.00 mg/g。还原糖含量较高的水解液完全水解后得到的可溶性总糖含量也高。酸、碱或高温高压预处理方法便于木质纤维素中半纤维素、纤维素和木质素的解离,有利于纤维素和半纤维素进一步水解成还原糖。该研究的高温蒸煮-酸法可能导致玉米芯中的多糖彻底降解为单糖,因此水解液中还原糖含量高。超声波辅助复合酶法可能由于超声波作用影响复合酶的活力,导致酶解效率偏低。

聚合度可用来衡量玉米芯中多糖被水解的程度,越接近1表明水解越彻底。高温蒸煮-酸法的聚合度为0.9,得到的还原糖基本都是单糖;碱-超声波辅助酶法的聚合度为2.05,其水解程度最低,含有较多的木聚糖。复合酶法、超声波辅助复合酶法、碱-酶法、酸-复合酶法的聚合度较合适,利于低聚木糖的制备。

2.2 玉米芯处理前后的结构分析

玉米芯预处理前后结构扫描电镜图见图1和图2。

图1 预处理前后玉米芯扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of corncob before and after pretreatment

图2 预处理前后玉米芯扫描电镜图Fig.2 Scanning electron micrograph of corncob before and after pretreatment

由图1和图2可知,粉碎后的玉米芯原料组织结构完整,没有破坏的痕迹;复合酶法和超声波辅助复合酶法的玉米芯残渣的组织结构出现了不同程度的空洞,结构变得疏松,表面粗糙不平整;高温蒸煮-酸法处理的玉米芯残渣组织结构平滑,聚集成块;碱-酶法和碱-超声波辅助酶法得到的玉米芯组织结构成碎片状,并粘连在一起;酸-复合酶法得到的玉米芯组织结构黏稠不成形,粘在一起,表面出现蜂窝。从玉米芯的组织结构变化可以看出,碱切断了玉米芯组织粘合成片,酸把玉米芯的结构打碎粘合成块,酶具有专一性,破坏了玉米芯组织,使玉米芯的组织结构出现空洞,变得疏松。木质纤维素玉米芯中的半纤维素以氢键和范德华力与木质素紧密连接,导致木质纤维素具有一定的抗降解能力,不同的预处理方法均为通过破坏纤维素、半纤维素和木质素之间的连接键,提高木质纤维素的降解效率。不同的玉米芯处理方法均使玉米芯结构变得微细化,出现多碎片,其组织表面已经由处理前的平面结构变成蜂窝状结构,玉米芯的组织结构受到了破坏,表面积与体积比增大,部分结构分解,产生了低聚合度的糖类物质[17]。

2.3 不同制备方法水解液中组分分析

2.3.1 薄层层析分析

不同制备方法的薄层层析见图3。

图3 薄层层析图Fig.3 Thin-layer chromatogram

由图3可知,复合酶法和超声波辅助复合酶法制备的水解液中主要为木糖、木二糖和木三糖,碱-酶法制备的水解液中主要为木四糖,高温蒸煮-酸法制备的水解液中主要为木糖和木二糖,碱-超声波辅助酶法制备的水解液中没有呈现明显的条带,酸-复合酶法制备的水解液中主要为木糖、木二糖和木三糖。

2.3.2 高效液相色谱分析

不同方法制备的水解液中低聚木糖各组分的含量见表2。

表2 玉米芯水解液组分分析

由表2可知,复合酶法制备的低聚木糖中木糖、木二糖、木三糖和木四糖含量分别为66.56,30.45,6.61,10.04 mg/g,低聚木糖得率为4.71%(以木二糖、木三糖和木四糖之和计),纤维素酶作用于木质纤维素中的纤维素,降低植物细胞壁的抗降解能力,有利于木聚糖的提取和水解,木聚糖酶可以将木聚糖的β-1,4-糖苷键定向水解生成低聚木糖;超声波辅助复合酶法制备的低聚木糖中木糖、木二糖和木三糖含量分别为43.35,17.81,1.04 mg/g,木四糖未检测出,低聚木糖得率为1.88%,超声波促使酶与底物作用,在较低温度和较短时间内完成水解反应,但超声功率过高会破坏酶的活性;碱-酶法制备的低聚木糖中木糖、木二糖和木四糖含量分别为64.37,57.89,42.83 mg/g,未检测出木三糖,低聚木糖得率为10.07%,碱法能够溶解木质素,破坏纤维素、半纤维素和木质素之间的连接,易于分离半纤维素,产物中含盐量高,需脱盐纯化;高温蒸煮-酸法制备的水解液中主要为木糖,含量为283.35 mg/g,未检测出木二糖、木三糖和木四糖,高温蒸煮利用高温水破坏木质素与半纤维素之间的连接,实现半纤维素有效分离[18],酸解法产物中单糖较多,水解程度不易控制;碱-超声波辅助酶法制备的低聚木糖中木糖、木二糖、木三糖和木四糖含量分别为28.51,73.28,11.13,39.91 mg/g,低聚木糖得率为12.43%;酸-复合酶法制备的低聚木糖中木糖、木二糖和木三糖含量分别为69.81,71.24,1.98 mg/g,未检测出木四糖,低聚木糖得率为7.32%。

3 结论

通过高温蒸煮-酸法、碱-酶法和酸-复合酶法制备的玉米芯低聚木糖水解液中还原糖的含量较高,超声波辅助复合酶法制备的水解液中还原糖含量最低。不同制备方法处理后的玉米芯残渣结构变得疏松多孔,部分呈现蜂窝状。

高温蒸煮-酸法制备的玉米芯水解液中主要为木糖,复合酶法、超声波辅助复合酶法、碱-酶法、碱-超声波辅助酶法和酸-复合酶法水解液中均含有不同量的木二糖、木三糖和木四糖,低聚木糖提取率分别为4.71%、1.88%、10.07%、12.43%和7.32%,其中碱-酶法、酸-复合酶法和碱-超声波辅助酶法制备的低聚木糖中木二糖含量较高,分别为57.89,71.24,73.28 mg/g;超声波辅助复合酶法制备的低聚木糖中木二糖含量最低,为17.81 mg/g。

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