高通量测序探究乳酸钠对冷鲜牛肉细菌群落结构的影响

唐远谋，孙劲松，庞紫琳，刘洋，潘攀，王新惠

(成都大学 食品与生物工程学院，成都 610100)

随着人们生活节奏的加快以及冷链系统的完善，人们对冷鲜肉制品的需求将越来越大[1]。冷鲜牛肉及其调理肉制品因其丰富的营养和鲜美的口感受到广大消费者的青睐，但在贮藏过程中牛肉极易滋生微生物，导致腐败变质。因此，如何抑制微生物生长、延长冷鲜牛肉的货架期是一个亟需解决的问题。

乳酸钠是肉制品中常见的添加剂，作为调味剂和保鲜剂添加在预调理肉制品中[2]，能够有效抑制冷鲜肉和肉糜在储藏过程中微生物的生长，延长货架期。针对不同的肉制品，如冷鲜肉、冷冻肉、腌腊肉制品等，常将乳酸钠与乳酸链球菌素(Nisin)、柠檬酸、山梨酸钾、双乙酸钠等其他食品添加剂复合使用[3]，以达到调味、延长货架期等目的[4]。 乳酸钠具有较好的抑菌能力，Grosulescu等研究表明[5]，乳酸钠在低温下对单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)具有较好的抑制效果。Masana等发现乳酸钠结合高压灭菌能够有效抑制腌制牛肉中的大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)以及其他腐败菌，并且发现3%的乳酸钠能有效降低大肠杆菌O157:H7的致病性[6]。

目前，16S rRNA扩增子测序技术已经在肉类的研究中得到广泛应用[7]，但大部分仅停留在对微生物相对丰度的探究上。而随着测序和分析技术的发展，如今绝对丰度的分析技术较成熟[8]，如Mou等[9]通过16S rRNA测序技术分析了绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素对人体肠道微生物群落绝对丰度的影响。微生物绝对丰度可以更准确地反映样品中微生物群落结构，避免了相对丰度分析时由于微生物A的减少而造成微生物B丰度升高的现象。

本研究将牛肉用乳酸钠的生理盐水溶液处理后进行4 ℃冷藏，用生理盐水进行相同处理作为对照，并将冷藏1～7 d的样品取样，采用16S rRNA扩增子测序技术，在相对丰度和绝对丰度的层面分析乳酸钠对牛肉的细菌群落结构以及演替规律的影响，为乳酸钠在冷鲜牛肉保鲜中的应用提供了理论支持。

1 材料和方法

1.1 样品的前处理与取样

实验选用市面上常见的西门塔尔牛肉，购于成都市十陵镇久贸综合市场。选取背最长肌肉，分割成50 g左右的小块后用无菌生理盐水洗净血水，并用浓度为3 g/dL的无菌生理盐水的乳酸钠溶液做浸泡处理[10]，浸泡时间为5 min，用无菌生理盐水浸泡相同时间作为对照组。用无菌塑封袋进行装袋，并迅速保存于4 ℃冰箱中冷藏，分别于第1天、第3天、第5天、第7天取样。每组的每个采样时间点取3个样品作为重复，空白组和实验组分别编号为C和SL。

1.2 实验主要试剂

Qiagen凝胶回收试剂盒、无水乙醇、液氮、氯化钠等：成都市科隆化学品有限公司；TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒：美国Illumina公司。

1.3 实验主要设备

琼脂糖凝胶电泳仪 美国Bio-Rad公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；AP-60-395LA型超低温冰箱 杭州艾普仪器设备有限公司。

1.4 实验方法

将牛肉样品取样后用液氮急速冷冻，并置于-80 ℃冰箱中保存，待测。采用CTAB法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳仪检测DNA的纯度和浓度[11]。采用16S V3-V4区通用引物(515F和806R)进行PCR扩增[12]。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳仪检测PCR产物，对目的条带使用Qiagen公司提供的凝胶回收试剂盒回收产物。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq 6000测序系统进行上机测序。

1.5 冷藏期间牛肉的感官评价

根据GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》以及GB/T 17238—2008《鲜、冻分割牛肉》的相关要求制定感官评价表，见表1[13]。并由10名经过培训的感官评价员对冷藏期间的样品进行感官评价，样品的每项指标得分之和除以10，即得到该项指标的得分，最后用5项指标得分之和表示感官总得分。

表1 牛肉的感官评定标准表Table 1 The sensory evaluation standard of beef

1.6 数据分析

利用uParse软件对所有样本的全部Effective Tags进行聚类[14]，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units)，筛选出现频率最高的OTUs序列作为代表序列，利用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)方法将数据进行校正[15]，得到每个样品中的绝对定量值，更加准确地表现样品中微生物群落的组成。使用Mothur方法与SILVA132的SSU rRNA数据库进行注释分析，设定阈值为0.8～1[16]，使用R以及OriginPro 2018作图。

2 结果与分析

2.1 冷藏期间样品感官得分

冷藏期间牛肉的感官得分情况见图1。

图1 冷藏期间感官得分变化曲线Fig.1 Change curve of sensory score during cold storage

由图1可知，在储藏的1～2 d，C组和SL组的得分值相近，第3天开始，C组开始低于SL组；第4天开始，两组的得分差值迅速增加。并且空白组牛肉煮沸后肉汤从第4天开始出现明显的异味，而实验组依然具备牛肉特殊的香味。当储藏第7天时，实验组得分依旧有(34.2±2.01)分，依旧保持较好的外观，而空白组仅(20.9±1.19)分，说明经过乳酸钠的处理，牛肉能够获得更长的货架期。

2.2 测序结果

图2 样品的OTU稀释曲线Fig.2 OTU dilution curve of samples

本实验通过将有效序列以97%的一致性聚类，共得到4884个OTUs，然后进行物种注释，得到30个门，346个属。并且由OTUs稀释曲线(见图2)可知，随着测序量的增加，得到的OTU数量逐渐趋于平缓，说明测序深度足够，实验结果可信。

2.3 Alpha多样性分析

表2 牛肉样品的Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes of beef samples

由表2可知8个样品的Alpha多样性指数。其中，Group代表组名，每个组的值由3个重复样品取平均值得到，Shannon和Simpson指数为微生物多样性指数，其数值越大表示微生物多样性越高。Chao1和ACE指数为微生物丰度指数，其值越大说明物种丰度越高。C组的微生物多样性指数随着储藏时间的延长而升高，Shannon和Simpson指数在第7天分别达到最大值2.28±0.36和0.64±0.06。而SL组则在第5天达到最大值，并在第7天微生物多样性有所减小；C组的细菌丰度在第1天最高，Chao1和ACE指数分别为288.36±30.07和306.10±20.06，而SL组的细菌丰度在第5天达到最高，Chao1和ACE指数分别为544.84±150.66和579.78±137.86，两组样品的细菌丰度在储藏期间均呈现上下浮动的变化趋势。在储藏初期，两组的细菌群落多样性和丰度值相近，而在储藏末期(第7天)，空白组的多样性指数大于实验组，丰度指数小于实验组。

2.4 细菌群落结构及演替规律分析

2.4.1 门水平

储藏1～7 d牛肉中细菌群落结构在门水平上的变化见图3，图3中a表示相对丰度前十的菌门，图3中b表示绝对丰度前十五的菌门，其横坐标为OTUs的丰度值。

图3 门水平上牛肉样品中细菌的群落结构Fig.3 The bacterial community structure of beef samples at the phylum level

由图3可知，第1天的6个样品细菌群落结构较相似，主要以Proteobacteria占主导，相对丰度达90%左右，其次是Firmicutes，相对丰度为1.06%～5.12%；第3天的C组3个样品与第1天的相比变化较大，主导菌为Firmicutes，相对丰度为93.20%～96.17%。SL3与SL1的变化不大，主导菌依然为Proteobacteria，相对丰度为87.97%～99.08%；第5天C5和SL5的6个样品中，相对丰度较高的分别为Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria。此外，在SL5.1中鉴定出Actinobacteria，其相对丰度为15.78%，绝对丰度为10220，但在SL5.2和SL5.3中其绝对丰度仅为20和278，说明样品SL5.1可能受到污染；第7天，C7中Bacteroidetes和Firmicutes的含量较多，平均丰度分别为38.87%和53.70%。SL7中依然为Firmicutes占据主导，相对丰度为94.88%～97.07%。

两组样品中细菌的演替规律为：空白组的优势菌从Proteobacteria演替为Firmicutes，最后再由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria共同主导；而实验组的优势菌由Proteobacteria演替为Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria主导，再到最后由Firmicutes作为绝对优势菌。与空白组相比，经过乳酸钠的处理会使Bacteroidetes的生长受到抑制。

2.4.2 属水平

属水平上，对冷藏期间牛肉的细菌群落结构做进一步分析，结构见图4，图4中a表示相对丰度前十的菌属，图4中b表示绝对丰度前十五的菌属。

图4 属水平上牛肉样品中细菌的群落结构 Fig.4 The bacterial community structure of beef samples at the genus level

由图4可知，第1天的6个样品中优势菌均为Ralstoniaspp.；第3天时，C组中相对丰度最高的菌属演替为Lactococcusspp.，相对丰度为78.23%～85.55%，绝对丰度值为43177～54437，其次为Weissellaspp.，相对丰度为7.46%～16.72%，绝对丰度为4355～9228。SL3的优势菌Ralstoniaspp.的相对丰度与SL1相近，平均相对丰度由SL1的93.83%变为SL3的93.46%，平均绝对丰度由56387下降到52568。此外，SL3中Lactococcusspp.的含量也有明显增加，平均相对丰度从SL1的0.01%增加到SL3的3.20%，平均绝对丰度由5增加至1579；第5天，C5演替成以Lactococcusspp.为主导，并且Myroidesspp.、Weissellaspp.、Kurthiaspp.、Paracoccusspp.等菌属也占有较大的比重，其平均丰度依次为68.29%、9.83%、8.82%、2.77%、1.43%。SL5的主要菌属为Lactobacillusspp.，丰度为45.85%～67.44%，其他菌属丰度高低依次为Weissellaspp.、Bifidobacteriumspp.、Lactococcusspp.、Bacteroidesspp.，其平均丰度分别为18.07%、5.05%、4.21%、1.03%；第7天，C7的主要菌属以及平均丰度分别为：Lactococcusspp. 43.16%，Myroidesspp. 37.76%，Serratiaspp. 4.80%，Lactobacillusspp. 3.87%，Weissellaspp. 2.97%；SL7的主要菌属以及平均相对丰度为：Lactobacillusspp. 70.60%，Weissellaspp. 17.32%，Lactococcusspp. 4.88%，Myroidesspp. 1.33%。

其中Ralstoniaspp.是一种近几年新发现的条件致病菌属，常见于土壤或者供水系统中[17]，它以绝对的占比优势成为C1和SL1多种样品中的优势菌，并且SL3的3个样品中Ralstoniaspp.依然具有较高的占比，说明乳酸钠的处理可以使初始菌属存活较长时间。Lactobacillusspp.和Lactococcusspp.两种菌属分别含有能产生细菌素Nisin[18]和sakacin P[19]的Lactococcuslactis和Lactobacillussakei，其产生的细菌素均可以作为安全的食品防腐剂。由图4中b可知，Lactobacillusspp.在SL5和SL7中含量较多，这可能是由于乳酸钠的添加形成了适宜Lactobacillusspp.生存的条件，导致Lactobacillusspp.在第5天之前取代了Ralstoniaspp.的优势地位，成为了样品中的绝对优势菌。而Lactococcusspp.在C3、C5和C7中含量较多，尤其是C3样品中，平均绝对丰度是SL3中的31倍。但随着储藏期的延长，其丰度有所下降，由第3天的平均绝对丰度49186下降至第7天的平均绝对丰度27132，这可能与Lactococcusspp.对低温不耐受有关。此外，从第3天开始，在空白组样品中检测出了Myroidesspp.，第3，5，7天的平均绝对丰度分别为1584，5481和22552，呈“指数型”增长，并且在C7样品中成为含量第二的优势菌属，这是一种可能引起菌血症、腔内感染或肺炎的条件致病菌[20-21]。此外，Weissellaspp.在SL组中后期(第3～7天)的样品中也有较高的丰度，Weissellaspp.是一种乳酸菌，常与食品中的风味物质形成有密切的关系[22]。由属水平的分析发现，仅在SL5.1含量较高的Actinobacteria可能是Bifidobacteriumspp.，这是一种人和动物体内常见的菌群，在食品中常作为益生菌[23-24]。

属水平上，对储藏期间牛肉的细菌群落结构分析，随着冷藏时间的延长，空白组出现两个丰度较高的优势菌属，即Lactococcusspp.和Myroidesspp.。而实验组的Lactobacillusspp.是储藏中后期(第5～7天)丰度最高的优势菌，SL5和SL7的平均绝对丰度分别为34338和45981，分别是第二优势菌Weissellaspp.的3.05倍和4.04倍。因此，经乳酸钠处理的冷鲜肉具有较长的保质期，可能主要与牛肉中高丰度的Lactobacillusspp.有关。

3 结论

本研究通过16S rRNA扩增子测序技术，探究乳酸钠浸泡处理的牛肉在储藏期间细菌群落结构的演替规律。通过Alpha多样性分析，发现在储藏初期，两组的细菌群落多样性和丰度值相近，而在储藏末期，经过乳酸钠浸泡处理的冷鲜牛肉的细菌多样性指数更低，丰度指数更高。通过细菌群落演替规律的分析，发现经乳酸钠的处理，牛肉样品中细菌群落结构在第3天以后才发生较大变化，而空白组前3 d的细菌群落结构较稳定。通过群落演替规律的分析，发现乳酸钠的处理对Lactococcusspp.、Myroidesspp.和Serratiaspp.等菌属的生长具有一定的抑制效果，而能够提升Lactobacillusspp.和Weissellaspp.在储藏中后期样品中的丰度，这可能是由于乳酸钠能够为这两种菌群的生长提供有利的环境。通过对C和SL两组空间距相等牛肉样品的细菌群落结构进行分析，发现Lactobacillusspp.在储藏的第5～7天丰度较高，其中Lactobacillussakei可以产生的细菌素sakacin P会进一步抑制其他细菌的生长，并且能够直接作为肉类防腐剂。但Lactobacillusspp.在实验组中丰度达60.65%～77.80%，其中Lactobacillussakei具体占据多大的比例，是否能在保鲜过程中起到关键作用，有待进一步探究。