超高效液相色谱-串联质谱法测定药材牛大力中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素

马博凯， 钱 冲， 王茂媛， 刘珊珊， 黄雯雯，王 尉， 勾新磊， 王祝年， 张 梅

(1.北京市科学技术研究院分析测试研究所(北京市理化分析测试中心)，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京 100094；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101；3.农业农村部热带农业野生植物基因资源鉴定评价中心/海南省热带药用植物工程研究中心，海南儋州 571737)

牛大力(MillettiaspecioseChamp)是豆科崖豆藤属植物的根，又名美丽崖豆藤，作为一种药食同源植物，主要分布在我国的广东、广西和海南等地[1]。在民间，牛大力广泛用于煲汤原料，且具有补虚润肺的保健功效[2]；其作为药物可用于调节人类免疫系统，如抑制肿瘤、抗菌[3]，对呼吸道疾病具有镇咳、平喘的功效[4]。牛大力中含有的黄酮类和生物碱类成分，如刺桐碱(Hypaphorine)、芒柄花素(Formononetin)和高丽槐素(Maackiain)[5]起到了主要的药理作用，他们的结构式见图1。其中，高丽槐素是检验牛大力质量的一个重要指标[3]，具有抑制癌细胞的增殖、克隆与迁移能力[6]；芒柄花素具有抗肿瘤生物活性，可用作抗肿瘤药物[7]；刺桐碱对消炎和抗肿胀具有一定效果[8,9]。因此，上述3种化合物可作为评价中药材牛大力优劣的关键指标成分，因此，建立简单、快速且能同时测定牛大力中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素含量的方法，对筛选优良品质的牛大力具有非常重要的实际意义。

图1 刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的化学结构式Fig.1 Chemical structures of hypaphorine,formononetin and maackiain

考察与评价不同生长周期的牛大力中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素3种化学成分的差异，对确定该药材的最佳栽培年限具有重要的指导作用。目前，牛大力中化学成分的分离、提纯、鉴定及药理作用是研究热点[1 - 4,10]，但对不同年份牛大力的品质评价研究却较少[11]。高效液相色谱法是检测牛大力中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素3种指标成分的主要方法[5,11 - 13]，而超高效液相色谱-串联质谱法具有更高的灵敏度和分离度，专属性更好、分析速度更快、基质效应更小、抗干扰能力更强等优点[14 - 16]，然而，还鲜见应用该技术同时测定牛大力中的刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的文献报道。本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法，通过优化色谱和质谱分析条件，建立了同时测定牛大力中上述3种指标成分的方法，并对不同生长周期牛大力中3种指标成分的含量进行了比较，确定了7年为最佳栽培年限，为中药材牛大力的科学采收、品质控制提供了重要的科学理论支持。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

WatersAcquity超高效液相色谱仪，配有Xevo TQ型三重四极杆质谱仪(美国，Waters公司)；Sartorius分析天平(日本，Shimadzu公司)；KQ-300GDV型恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

标准品刺桐碱、高丽槐素和芒柄花素来自成都植标化纯生物技术有限公司(纯度≥98%)。乙醇、甲醇(色谱纯，纯度99.9%)购自美国Fisher公司。中药材牛大力样品由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2 混合标准系列溶液的配制

分别精确称取标准品刺桐碱6.0 mg、芒柄花素12.5 mg和高丽槐素20.0 mg，用甲醇定容至10 mL，作为标准储备溶液，再用75%甲醇将其稀释成混合标准系列工作溶液。所有溶液在4 ℃保存备用。

1.3 样品制备

准确称取牛大力样品粉末500 mg(过三号筛)，置于150 mL锥形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，称定重量，超声提取30 min,静置放冷至室温，再称定重量，并用75%甲醇补足重量。取1 mL上清液，置于10 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，混匀，过0.22 μm有机滤膜后，上机测试。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序：0～6 min，10%A→90%A；6～8 min，90%A；8～8.50 min，90%A→10%A；8.50～10 min,10%A。柱流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL。

质谱条件：离子源为ESI源，扫描模式为负离子；监测模式为多反应监测(MRM)。优化后的参数如下：毛细管电压3.2 kV；离子源温度150 ℃；锥孔气流速20 L/h；锥孔电压10.0 V；去溶剂气温度350 ℃；去溶剂气流速650 L/h。各待测物质的母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能等参数见表1。

表1 刺桐碱、高丽槐素和芒柄花素的质谱分析参数

(续表1)

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

采用流动注射方式，分别将刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的标准溶液注入离子源，利用正负离子扫描模式，选择合适的电离方式。结果表明，3种目标分析物在负离子模式下产生的信号较强，均可获得较高丰度的[M-H]-准分子离子峰。采用二级质谱子离子扫描方式确定定量离子和定性离子，调节锥孔电压和碰撞能量，使3种分析物的离子化效率达到最佳，结果见表1。

2.2 色谱条件的选择

考察了甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相对刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的分离效果。结果显示，以乙腈-0.1%甲酸作为流动相时，刺桐碱的峰形差、有分叉；芒柄花素峰形有拖尾，整体分离效果欠佳，如图2A所示。采用甲醇-0.1%甲酸作为流动相时，刺桐碱和高丽槐素峰形均好，且芒柄花素无明显拖尾现象，3种目标分析物在10 min内实现完全分离，分离效果好，如图2B所示。因此选择甲醇-0.1%甲酸水体系作为流动相。

图2 刺桐碱(750 μg/L)、芒柄花素(31.2 μg/L)和高丽槐素(500 μg/L)在乙腈-0.1%甲酸溶液(A)和甲醇-0.1%甲酸(B)中的选择离子色谱图Fig.2 Selected ion chromatograms of hypaphorine(750 μg/L),formononetin(31.2 μg/L) and maackiain(500 μg/L) in acetonitrile -0.1% formic acid(A) and methanol-0.1% formic acid systems(B)

2.3 线性关系、定量限及检出限

用甲醇将3种分析物的标准储备溶液分别稀释成刺桐碱质量浓度为60～6 000 μg/L、芒柄花素质量浓度为1～125 μg/L，以及高丽槐素质量浓度为100～2 000 μg/L的混合标准系列工作溶液，在上述的分析条件下进行测定。以峰面积(Y)对相应的质量浓度(X，μg/L)绘制标准曲线，结果表明3种分析物在各自的浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.99。以信噪比(S/N)=3计算3种分析物的检出限，以S/N=10计算其定量限，结果见表2。可以看出，刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的检出限分别为2 μg/g、0.02 μg/g和30 μg/g。

表2 3种分析物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4 样品检测、回收率和重复性

应用所建立方法，测定生长周期为7年的牛大力样品中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的含量，样品的选择离子流色谱图见图3。结果显示，所测定3份样品中刺桐碱含量分别为2416±60、2350±51、2323±51 μg/g；芒柄花素含量分别为28.2±0.3、28.1±0.4、28.8±0.5 μg/g；高丽槐素的含量分别为308±7.7、303±8.1、296±7.4 μg/g。

图3 实际样品的选择离子流色谱图Fig.3 Selected ion current chromatograms of real samples

选取2号样品作为本底值，考察方法的加标回收率和重复性。并根据样品含量向样品基质中分别加入50%、100%和150%的3个级别的目标分析物，平行配制6份，然后进行测定。结果如表3所示，刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素的平均回收率为86.0%～104%，相对标准偏差(RSD)为2.12%～5.57%，表明本方法加标回收率和重复性良好，可满足实际样品的分析要求。

表3 回收率和精密度实验结果(n=6)

2.5 不同年限牛大力中3种指标成分含量的分析

采用本方法分别对生长周期为3年、7年、10年和15年的牛大力实际样品进行了分析检测。图4是4个不同生长周期牛大力中3种指标成分含量的汇总图。从图4可见，生长周期为7年的牛大力中刺桐碱和高丽槐素的含量最高。虽然芒柄花素随着生长年龄的增加其含量呈下降趋势，但生长7年牛大力中芒柄花素的含量较3年的减少不明显。因此，综合3种有效成分的含量比对，可以得出牛大力的最佳栽培年限为7年。

图4 不同生长周期牛大力中3种分析物的含量差异图Fig.4 Content differences of 3 analytes in Millettia speciose Champ with different ages

3 结论

本研究建立了一种同时测定中药材牛大力中刺桐碱、芒柄花素和高丽槐素3种有效成份的超高效液相色谱-串联质谱法。该方法具有简单、分离速度快、灵敏度高、基质背景干扰少的特点，能对实际样品牛大力进行分析检测。同时，利用该方法考察了生长周期为3年、7年、10年和15年的牛大力中3种指标成分的差异及动态变化规律，从功能性活性成分积累高峰的角度，确定了生长周期为7年的牛大力是最佳栽培年限。该研究为实现其科学采收、品质控制及产品开发提供了必要的科学理论依据。