基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T荧光“turn-on”模式的腺苷三磷酸检测

刘兴奋*， 孙 棋， 王 蕾， 黄艳琴， 范曲立

(南京邮电大学材料科学与工程学院，有机电子与信息显示国家重点实验室，江苏省生物传感材料与技术重点实验室，江苏南京 210023)

核酸适配体(Aptamer,Apt)是人工合成的一小段单链DNA或RNA，对目标物质具有高度亲和力和特异性。核酸适配体可通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从含有随机核苷酸的单链核酸分子文库中筛选得到[1,2]。迄今为止，已报道了各种目标物质的核酸适配体，包括金属离子(K+、Pb2+、Na+、Sr2+)[3 - 6]、有机小分子(ATP、L-精氨酸)[7,8]、蛋白质(肿瘤标志物、凝血酶、干扰素、血管内皮生长因子)[9 - 12]、癌细胞[13]和微生物(如炭疽病毒)[14]等。与抗体蛋白相比，核酸适配体分子量小，易于化学合成和修饰，稳定性高且成本较低，可克服抗体在应用中存在的局限性[15]。目前，核酸适配体已被广泛用于生物分析、细胞成像、药物递送、靶向治疗、食品污染检测等领域[16 - 20]。近年来，研究者们将各种纳米材料和技术与核酸适配体相结合，开展了广泛深入的研究。Yuan课题组[21]开发了一系列可持续发光的纳米材料，并用核酸适配体进行功能化，可有效降低生物基质的自荧光，提高血清中靶物质检测的灵敏度和肿瘤成像的分辨率。Yang课题组[22]构建了一种多价适配体功能化的微流控生物芯片，可以有效提高对循环肿瘤细胞的捕获和释放效率。Qi等[23]将适配体修饰在DNA四面体纳米笼上，并将药物阿霉素包裹在笼内，这种纳米药物不仅提高了药物的选择性，而且降低了对生物体系的毒性，安全性更好。Lin课题组[24]构建了基于DNA四面体的负载抗癌药物5-氟尿嘧啶的新型纳米药物，有效提高了乳腺癌治疗的靶向性和疗效。

腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)是生命体系的能量分子，在细胞代谢和生化反应中都起着重要作用。目前，已报道的各种基于核酸适配体的ATP检测方法，如荧光法、比色法、化学发光、电化学发光、表面增强拉曼散射、表面等离子体共振等[25 - 28]，大多是基于完整核酸适配体设计的。然而，未拆分的核酸适配体链相对较长，容易形成链内或链间二级结构，影响其与ATP的结合。研究者发现，将完整核酸适配体拆分为两条较短的拆分型适配体，并对序列进行合理设计，可构建类似或完全不同于完整核酸适配体的传感策略，在一定程度上弥补完整适配体在应用中的不足[29 - 34]。

荧光分析是一种灵敏度高、选择性好的生物传感检测方法。然而，由于引起荧光猝灭的因素较多(如溶剂、pH、温度等)，“turn-off ”模式的荧光分析容易出现假阳性问题，特别是在检测复杂体系和细胞内生物分子时，其灵敏度和特异性还有待于提高。因此，亟需开发新型的荧光“turn-on”模式的简便、快速且高灵敏度的生物分析方法，实现对血清、尿液、唾液等实际样品中靶物质的检测。硫代黄素T(Thioflavin T,ThT)是一种苯并噻唑盐荧光染料，具有独特的荧光性质。当其以游离状态存在时，可发射非常微弱的荧光；然而，当其嵌入G -四链体结构时，由于分子内C-C单键的旋转受限，使其分子呈平面化，荧光显著增强。目前，ThT已被作为一种对核酸拓扑结构具有高度选择性的荧光染料[35 - 37]，用于各种无标记荧光探针的设计及光学生物传感分析。本研究中，我们构建一种基于拆分型核酸适配体和ThT的荧光“turn-on”模式的检测方法，通过比较三组拆分型核酸适配体探针的荧光光谱，筛选出一组性能优异的探针，成功实现了对复杂体系中ATP的快速、灵敏、无标记检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu RF-6000荧光分光光度计(日本，岛津公司)用于荧光光谱检测。荧光光谱测量条件：氙灯激发，激发波长440 nm，扫描范围460～650 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。所有样品的测定均在室温进行。K30干式恒温器(奥盛仪器有限公司(杭州))用于加热。

寡核苷酸由上海生工生物工程股份有限公司合成，并通过高效液相色谱(HPLC)纯化。三组ATP的拆分型核酸适配体的碱基序列见表1。腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)和脱氧核苷酸混合物(dNTPs)，均购自上海生工生物工程股份有限公司。硫代黄素T(ThT)购自上海领潮生物科技有限公司。胎牛血清(Gibco)购自KeyGen生物(南京)有限公司。所有缓冲溶液均使用Milli-Q水(18.2 MΩ·cm)配制。缓冲溶液Ⅰ(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.0)用于DNA溶液的配制和稀释。缓冲溶液Ⅱ(5 mmol/L MgCl2,15 mmol/L KCl,100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH=7.4)用于ATP、核酸适配体和ThT之间的反应，以及后续的荧光光谱检测。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA预处理为去除核酸适配体的二级结构，在使用前对核酸适配体溶液进行预处理。将4 μL 10 μmol/L的DNA溶液与一定体积缓冲溶液Ⅱ，在95 ℃加热5 min，然后在冰上孵育10 min。

1.2.2 可行性分析三组拆分型核酸适配体对ATP的初步检测。在预处理的Apt-1/Apt-2、Apt-3/Apt-4、Apt-5/Apt-6中，分别加入4 μL 100 μmol/L的ThT溶液。一组作为空白，另一组加入4 μL 100 mmol/L的ATP作为阳性对照。加入缓冲溶液 Ⅱ 至反应体积为100 μL，37 ℃孵育60 min。最后再加入一定体积的缓冲溶液Ⅱ至400 μL，在440 nm激发波长下测量荧光光谱。以下所有实验中，ThT的用量及后续反应温度和时间均与该实验中相同。

拆分型核酸适配体与ThT之间的相互作用研究。在预处理的Apt-1、Apt-2和Apt-1/Apt-2中分别加入4 μL 100 μmol/L的ThT溶液。37 ℃孵育60 min，然后进行荧光检测。

1.2.3 特异性分析向预处理的Apt-1/Apt-2溶液中，分别加入4 μL 100 mmol/L的ATP、GTP、CTP、UTP和dNTPs，然后再加入ThT溶液和缓冲溶液Ⅱ。37 ℃孵育60 min后进行荧光检测。只含有Apt-1/Apt-2和ThT的样品作为空白对照。

1.2.4 灵敏度分析向预处理的Apt-1/Apt-2溶液中，加入浓度为100 mmol/L的ATP溶液，体积分别为0、0.2、0.4、0.5、2、3、4 μL，然后再加入ThT溶液和缓冲溶液Ⅱ进行反应。其他实验过程与可行性分析中一致，重复实验三次。

1.2.5 10%血清中ATP的检测血清体系中ATP的初步检测。在缓冲溶液Ⅱ中加入一定量胎牛血清，配制含10%血清的缓冲溶液Ⅱ。向预处理的Apt-1/Apt-2中加入4 μL 100 mmol/L的ATP溶液，然后加入ThT和一定体积含10%血清的缓冲溶液Ⅱ。37 ℃孵育60 min，加入一定体积含10%血清的缓冲溶液Ⅱ至400 μL，进行荧光光谱测量。

2 结果与讨论

2.1 传感策略

基于拆分型核酸适配体和ThT荧光“turn-on”模式的ATP检测原理如图1所示。Apt-1和Apt-2为将完整核酸适配体进行拆分，并对碱基序列进行优化的两段DNA，作为识别靶分子ATP的探针。ThT为可特异性结合G -四链体的荧光染料，作为光学报告基团。当体系中只有Apt-1、Apt-2和ThT时，由于Apt-1和Apt-2均为富G序列，在ThT的诱导下，两段DNA链可分别形成含少量G4片层的分子内G -四链体。嵌入G -四链体片层的ThT分子的数量与G4片层的数量成正比，此时体系荧光较弱。当体系中存在ATP时，由于ATP与适配体分子之间具有更高的亲和力和特异性[38]，会形成由Apt-1、ATP、Apt-2构成的分子间G -四链体结构。该结构含有更多G4片层，因而嵌入ThT分子的数量更多，体系的荧光显著增强。因此，通过检测体系的荧光变化，可实现对靶分子ATP的简便、快速和特异性检测。

图1 (A)基于拆分型核酸适配体与硫代黄素T(ThT)的ATP检测原理图;(B)ThT的化学结构式Fig.1 (A) Scheme of ATP detection strategy based on split aptamer and ThT;(B) Chemical structure of ThT

2.2 可行性分析

首先，对拆分型核酸适配体探针的序列进行优化。共设计三组拆分型适配体：末端分别添加两组GGG序列的探针Apt-1和Apt-2；未添加任何序列的直接拆分型适配体Apt-3和Apt-4；末端分别添加一组GGG序列和三组GGG序列的探针Apt-5和Apt-6。三组探针的碱基序列、碱基数量和G含量如表1所示。

分别用三组探针对ATP进行初步检测。如图2A所示，用Apt-3和Apt-4进行ATP检测时，空白组和加入ATP的实验组的荧光信号都非常弱，表明无论是否存在ATP分子，探针都不能形成G -四链体结构。这是由于Apt-3和Apt-4的DNA链较短且串联重复的G序列较少的缘故。用Apt-5和Apt-6进行ATP检测时，空白组荧光非常强，加入ATP的实验组荧光增强幅度较小，约为13%，尚未达到能与空白显著区分的程度。这是由于Apt-6的G含量相对较高且有较多的串联重复G碱基存在，其自身很容易形成G -四链体，导致空白背景信号较高。相比而言，用Apt-1和Apt-2检测ATP时(图2B)，空白组荧光较弱，阳性对照组荧光信号明显增强，二者具有显著差异，有望用于ATP的特异性检测。

进一步研究了Apt-1、Apt-2及Apt-1/Apt-2分别与ThT相互作用后体系荧光的变化。如图2C所示，游离的ThT几乎不发射荧光，这是由于分子内C-C单键的旋转产生无辐射衰减，导致荧光猝灭的缘故。单独的Apt-1、Apt-2由于可形成少量分子内G4片层，ThT嵌入G -四链体后荧光有一定程度增强。当Apt-1和Apt-2与ThT共同作用后，与单独的Apt-1/ThT和Apt-2/ThT体系相比，荧光增强幅度非常小，表明ThT分子本身并不能诱导Apt-1和Apt-2形成分子间G -四链体。然而，向该体系中加入靶物质ATP后，由于ATP诱导的分子间G -四链体的形成，荧光强度可增强至原来的2倍(图2B)。此外，以单独的Apt-1或Apt-2为探针，对ATP进行了检测。结果显示，与Apt-1/Apt-2/ThT/ATP体系相比，Apt-1/ThT/ATP和Apt-2/ThT/ATP体系的荧光都非常弱，表明单独的Apt-1或Apt-2探针不能用于ATP检测，只有Apt-1和Apt-2同时存在时才可以特异性识别并结合ATP。基于上述分析，以Apt-1、Apt-2为优选探针，进一步研究其在ATP检测方面的综合性能。

图2 Apt-3/Apt-4和Apt-5/Apt-6(A)、Apt-1/Apt-2(B)检测ATP的荧光光谱图；Apt-1、Apt-2和 Apt-1/Apt-2分别与ThT作用后的荧光光谱图(C)Fig.2 Fluorescence spectra for ATP detection based on Apt-3/Apt-4 and Apt-5/Apt-6(A),Apt-1/Apt-2(B);Fluorescence spectra for ThT,Apt-1/ThT,Apt-2/ThT,and Apt-1/Apt-2/ThT(C)

2.3 特异性分析

为了研究该方法检测靶物质ATP的特异性，将鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)作为阴性对照进行检测，三者在体系中的浓度与ATP相同，均为1 mmol/L。此外，对脱氧核苷酸混合物(dNTPs)中的ATP也进行了检测，以初步分析该方法在复杂体系中检测靶物质的性能。如图3所示，空白组和三个对照组GTP、CTP和UTP体系的荧光强度都比较低。而实验组ATP和dNTPs体系的荧光信号都显著增强。表明拆分型核酸适配体对ATP具有高度选择性。由于dNTPs中除了含有GTP、CTP和TTP以外，也含有相同浓度的ATP，因此具有显著的荧光响应。进一步对腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)进行检测的结果显示，ADP和AMP的荧光信号分别为ATP信号的60%和39%，表明该方法对ADP和AMP的区分程度与文献报道[39]一致。上述研究证明，这种基于拆分型核酸适配体的方法对ATP检测的特异性和选择性都较高，其他核苷酸的存在对其检测的干扰很小。

图3 基于Apt-1/Apt-2和ThT的ATP、GTP、CTP、UTP和dNTPs检测Fig.3 Detection of ATP,GTP,CTP,UTP,and dNTPs based on Apt-1/Apt-2 and ThT

2.4 灵敏度分析

缓冲溶液中不同浓度ATP(0、50、100、125、500、750、1 000 μmol/L)的检测结果如图4所示。随着ATP浓度在0～1 000 μmol/L范围内的逐渐增大，体系的荧光强度逐渐增加，表明ATP浓度与荧光强度之间呈正相关性。进一步分析发现，在ATP浓度为0～500 μmol/L范围内，荧光信号与ATP的浓度之间具有良好的线性关系，回归方程为：y=0.66x+364.38(R2=0.9640)。其中y代表荧光强度值，x代表ATP的浓度(μmol/L)。根据3σ规则，计算得出在缓冲溶液中检测ATP的检测限为220 μmol/L。

图4 ATP浓度(0～1 000 μmol/L)与荧光强度之间的关系图(插图中ATP浓度为0～500 μmol/L)Fig.4 Relationship between the concentration of ATP(0-1000 μmol/L) and fluorescence intensity(Inset:concentration of ATP is 0 - 500 μmol/L)

2.5 10%血清中ATP的检测及灵敏度分析

为了进一步评价该方法的实用性，对稀释血清样品中的ATP进行了分析检测。首先，比较和分析了缓冲溶液和血清体系中相同浓度ATP检测的荧光光谱，如图5A所示。与缓冲溶液中ATP检测的荧光信号相比，在10%胎牛血清中进行同一浓度的ATP检测时，空白组和实验组的荧光信号都有升高。这是由于血清中含有的K+、Na+、Pb2+及凝血酶也可诱导富G序列形成G -四链体，因而会有更多的ThT分子嵌入G -四链体而发光[3,10,38]。值得注意的是，与空白组相比，加入ATP的阳性组的荧光强度仍可增加至空白的2倍多，初步表明该方法可以用于血清中靶物质的检测。其次，对10%血清体系中不同浓度的ATP(0、25、50、100、150、350、500、750、1 000 μmol/L)进行了检测。在0～1 000 μmol/L浓度范围内，体系的荧光信号随ATP浓度的增加而逐渐增强，如图5B所示。在0～100 μmol/L范围内呈快速增加趋势；在100～1 000 μmol/L范围内增速较缓慢。进一步对更低浓度范围的ATP(0、1、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L)进行了检测(图5C)。结果显示，ATP浓度在15～40 μmol/L范围内，荧光信号基本趋于稳定；而在0～15 μmol/L浓度范围内，荧光强度与ATP浓度之间具有较好的线性关系，其回归方程为：y=17.27x+434.56(R2=0.9358)。根据3σ原则，计算得出10%血清体系中对ATP的检测限为2.2 μmol/L。以上结果表明，成分复杂的血清体系中干扰物质的存在不仅没有影响对ATP的检测，而且与缓冲溶液中相比，对ATP检测的灵敏度提高了两个数量级。原因可能是血清体系中的离子环境更适于ATP与核酸适配体之间的特异性结合，形成的G -四链体更稳定，嵌入的ThT分子更多，体系的荧光信号更强，从而使灵敏度有一定程度的提高。

图5 (A)缓冲溶液和10%血清中ATP检测的荧光光谱对比；(B)10%血清中高浓度ATP(0～1 000 μmol/L)检测结果；(C)10%血清中低浓度ATP(0～40 μmol/L)检测结果(插图中ATP浓度为0、1、5、10、15 μmol/L)Fig.5 (A) Comparison of ATP detection in buffer and 10% FBS;(B) Detection of ATP at high concentrations(0 - 1 000 μmol/L) in 10% FBS；(C) Detection of ATP at low concentrations(0 - 40 μmol/L)(Inset:concentration of ATP is 0,1,5,10,15 μmol/L,respectively)

2.6 方法的回收率实验

对10%血清体系中的ATP进行了检测和回收实验分析。如表2所示，当ATP的加标浓度为5、7.5、10 μmol/L时，其加标回收率位于95%～105%范围内，相对标准偏差(RSD)为4%～7%，表明该方法具有较高的准确性和良好的稳定性。

表2 10%血清体系中的加标回收率分析(n=3)

2.7 不同分析方法的比较

比较分析了文献报道的几种基于核酸适配体与ThT的ATP荧光检测方法(表3)。这几种方法虽然具有较高的灵敏度，但无论是基于完整适配体还是拆分型适配体，其传感原理都是“turn-off ” 模式的光学检测，实际样品中的复杂组分可能会对检测结果造成干扰。相比而言，本研究中建立的基于优化拆分型核酸适配体的方法，不仅实现了“turn-on” 模式的靶物质分析，而且在复杂的血清体系中表现出更优异的检测性能。

表3 几种基于核酸适配体和硫代黄素T的ATP荧光检测方法比较

3 结论

本研究中，我们报道了一种荧光“turn-on”模式且无需标记的ATP检测新方法。该方法利用荧光染料ThT对G -四链体具有高度选择性的特点，合理优化了拆分型核酸适配体的DNA序列，实现了对靶物质的快速、灵敏、低成本检测。此外，这种方法还具有较高的实际应用价值，用于稀释血清中的ATP检测时，具有良好的抗干扰性和更高的灵敏度，在化学与生物传感、临床检验与分析检测等领域具有较好的应用潜力。