刺桐叶过氧化物酶对水体中联苯胺的降解

王雨雪 刘梦龄 王辛 肖强

摘要：探讨刺桐（Erythrina variegata Linn.）叶片过氧化物酶在清除水体中EDCs的应用前景，对刺桐叶过氧化物酶与H2O2形成的催化体系降解联苯胺的效果和反应条件进行研究。结果表明，刺桐过氧化物酶生物催化体系对联苯胺有良好的降解效果。在温度25～45 ℃，pH 7～8，H2O2与联苯胺物质的量浓度比为3.0～5.0条件下，10 U/mL刺桐过氧化物酶浓度对200 μmol/L联苯胺的3 h降解率达100%，效果最佳。

关键词：刺桐（Erythrina variegata Linn.）；过氧化物酶；联苯胺；降解

中图分类号：Q55 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）14-0042-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.009 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In order to develop economic value of the leaves，investigated the application prospect of the peroxidase in the Erythrina variegatas leaves in the removal of EDCs in water. The effect and best reaction conditions for the degradation of benzidine by E. variegata peroxidase-H2O2 were studied. The results showed that the E. variegata peroxidase-H2O2 had degradation effects on benzidine. Respectively，suitable reaction conditions： Temperature of 25～45 ℃， pH 7～8，H2O2/BZ=3.0～5.0（benzidine and hydrogen peroxide molar ratio），when the concentration of peroxidase was 10 U/mL，the best scavenging rate to benzidine （200 μmol/L） was 100%.

Key words： Erythrina variegata Linn.； peroxidase； benzidine； degradation

聯苯胺类化合物被广泛用于印染、纺织、皮革等行业。该类化合物具有较高的毒性，在芳胺化合物中，联苯胺（Benzidine，BZ）的致癌性仅次于2-萘胺[1]，长期接触联苯胺可增加罹患肺癌的风险[2]，尤其是职业接触[3]。目前联苯胺废水的处理方法有电解法、化学催化氧化法、微生物降解法、光催化法。电极催化法耗电量大、工序复杂[4]、经济效益低。利用热活化过硫酸盐可以降解废水中的联苯胺[5]。微生物降解法绿色无污染[6]，但周期长，在恶劣的污水环境中微生物生存能力会受到限制。光电催化法多利用光催化剂催化降解联苯胺[7]，高效廉价，但降解率较低。过氧化物酶催化降解联苯胺法是近年来新兴的酚污染降解法，以其微量、高效、绿色经济的特点受到关注。

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种以过氧化氢为电子受体[8]，通过催化底物发生氧化反应改变结构，引起底物理化性质发生变化的生物催化剂。它广泛分布于动植物和微生物体内，在细胞中发挥催化降解过氧化氢作用。过氧化物酶催化活性在工业上也用于石化、造纸、纺织等行业废水中酚类和芳香胺类污染物高效降解[9]。国内外许多学者开展了过氧化物酶用于医疗诊断、废物脱色、胺类、酚类物质降解的条件优化、动力学特性和反应机理研究[10]，最早采用过氧化物酶降解废水中的酚类和芳香胺类化合物，并将其用于含酚废水的脱色，该过氧化物酶对底物的氧化是高度非特异的[11]，这使得利用过氧化物酶结合过氧化氢催化氧化降解联苯胺成为可能[12]。

刺桐（Erythrina variegata Linn.），多年生落叶乔木，具有独特的观赏价值，在中国华南地区园林中被广泛应用[13]。在其生长过程中，大量的刺桐叶片凋落，刺桐叶过氧化物酶具有较高活性、稳定性较好。本研究通过提取刺桐中的过氧化物酶，构建过氧化物酶-H2O2生物催化体系，利用控制单因素变量法研究刺桐过氧化物酶催化降解水环境中联苯胺的最佳反应条件，单因素变量包括过氧化物酶酶量、温度、pH、H2O2与联苯胺物质的量浓度比等。旨在充分利用刺桐，提高其经济价值，探索一种高效、经济、清洁的联苯胺污染处理方法的工艺条件，以期为生物催化氧化法降解工业废水中联苯胺类提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以湖北民族学院植物园内种植的10年生刺桐（经湖北民族学院林学园艺学院易咏梅教授鉴定）成熟叶为原料。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制备 采摘成熟无病虫害刺桐树叶，去除主脉，剪碎，称取50 g，自来水洗净后，用去离子水冲洗，再用吸水纸吸干表面水分。分次加入250 mL预冻的含5% PVP-K30（聚乙烯吡咯烷酮-K30）和2 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）的冰水混合磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.8）匀浆，4 ℃下5 000 r/min离心，上清液即为粗酶液，置于4 ℃保存。

1.2.2 酶活的测定 参考Amako等[14]的方法并稍做改进。

1）反应混合液配制。取50 mL磷酸缓冲液于烧杯中，加入28 μL愈创木酚于恒温式磁力搅拌器上加热搅拌，直至完全溶解。待溶液冷却后加入19 μL 30% H2O2溶液，搅拌混匀后置于4 ℃低温保存。

2）酶活性测定。反应体系共4.0 mL（1.9 mL 100 mmol/L的磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 6.0，含1 mL 40 mmol/L愈创木酚和1 mL 40 mmol/L H2O2，0.1 mL酶液），于波长470 nm，30 ℃下记录OD变化。1个酶单位定义为测定条件下每分钟OD470 nm变化0.1所需的酶量。

1.2.3 酶活力计算 以每分钟OD变化（升高）0.1个酶活性单位（U），按下式计算活性[15]。

其中，ΔA470 nm指反应时间内吸光度的变化；W指取酶液总蛋白质质量（g）；t指反应时间（min）；Vt指取酶液总体积（mL）；Vs指测定时取用酶液体积（mL）。

1.2.4 联苯胺降解条件 研究最佳酶浓度时，在0.05 mol/L pH为7的磷酸-柠檬酸缓冲液中，含200 μmol/L联苯胺（后续试验均使用此浓度）、200 μmol/L过氧化氢，反应温度25 ℃（在集热式恒温加热磁力搅拌器上操作），设置酶浓度分别为2、5、10 U/mL，之后对其他降解条件的研究除变量外均采用此条件。研究最佳温度时，设置的反应温度分别为25、30、35、40、45、50 ℃。研究最佳pH时，采用0.05 mol/L缓冲液体系，pH 3～5采用乙酸缓冲液，pH 7～8采用磷酸盐缓冲体系，pH 9采用硼酸盐缓冲液。研究最佳H2O2与联苯胺物质的量浓度比时，按照H2O2与联苯胺物质的量浓度比为0.2、0.5、0.8、1.2、2.0、3.0、5.0加入物质的量溶液。反应混合物置于恒温水浴锅中搅拌，加入物质的量溶液启动反应，反应体系共20 mL。于反应0（未加物质的量时）、1、3、5、15、45、90、120、180 min取1 mL反应溶液，加入2 mL甲醇终止反应，即实现刺桐叶片过氧化物酶对联苯胺的降解。在终止反应液里加入适量明矾，摇匀，过夜沉淀后，5 000 r/min离心10 min。上清液过0.22 μm滤膜后检测联苯胺含量。

1.3 分析方法

1.3.1 色谱分析条件 联苯胺浓度采用高效液相色谱-飞行时间质谱法[16]测定，采用Agilent公司ZORBAX C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱。流动相为50%甲醇-水溶液，柱温30 ℃，体积流量0.2 mL/min。

1.3.2 质谱分析条件 ESI离子源负模式，干燥气温度350 ℃，流速10 L/min；雾化器压力45 psig，毛细管电压3 500 V，毛细管出口电压150 V，锥孔电压65 V，采集速度1.5 spectra/s，选择离子（ESI）采集方式，选定的分子离子[M-H]-的质荷比为184.2（联苯胺）。

2 结果与分析

2.1 最佳降解酶浓度确定

在pH 7的磷酸缓冲液中，含200 μmol/L聯苯胺，400 μmol/L H2O2，反应温度25 ℃，改变酶浓度（2～10 U/mL），考察不同酶浓度对降解联苯胺的影响，结果见图 1。从图1可以看出，随着反应体系酶浓度的升高，联苯胺最终剩余率不断下降，当酶浓度达到10 U/mL时，3 h后可以完全降解联苯胺，低于此浓度则不能完全降解，这主要由于酶浓度较低时单位体积反应溶液中无法提供一定数量的活性中心，造成联苯胺降解率降低。

2.2 最佳降解pH的确定

在缓冲液中，含200 μmol/L联苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL过氧化物酶，温度为25 ℃，用醋酸-醋酸钠、磷酸-柠檬酸、硼砂缓冲液控制反应体系pH（3～9），考察不同pH对刺桐叶片过氧化物酶降解联苯胺的影响，结果见图 2。从图2可以看出，在pH为8时，催化反应经过90 min对联苯胺的降解率达到100%，pH为7时，3 h后对联苯胺的降解率也能达到100%。在pH 3～8时，联苯胺降解率有随着pH的升高逐渐升高的趋势，在pH 9条件下，联苯胺不能被完全降解。

2.3 最佳降解温度的确定

在pH 7的磷酸缓冲液中，含200 μmol/L联苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL过氧化物酶，改变温度（25～50 ℃），考察不同温度对刺桐叶片过氧化物酶降解联苯胺的影响，结果见图 3。从图3可以看出，在温度为25～45 ℃时，3 h后反应体系中的联苯胺均能被完全降解，且趋势表现为随着温度的升高催化反应速率逐渐减慢，在温度为25 ℃条件下，催化反应经过90 min即可完全降解联苯胺，温度为50 ℃条件下，3 h后联苯胺的降解率只有70%左右。

2.4 最佳降解H2O2浓度的确定

在pH 7的磷酸缓冲液中，含200 μmol/L联苯胺，400 U/mL过氧化物酶，温度为25 ℃，按照H2O2与联苯胺物质的量浓度比为0.2～5.0加入H2O2溶液，考察H2O2与联苯胺不同摩尔比对刺桐叶片过氧化物酶降解联苯胺的影响，结果见图4。从图4可以看出，当H2O2与联苯胺物质的量浓度比为3.0～5.0时均能达到100%的降解率。H2O2与联苯胺物质的量浓度比在3.0～5.0以下时，3 h后联苯胺的降解率和降解反应速率随着物质的量浓度比的增大而增大。综合上述分析，刺桐过氧化物酶-H2O2催化降解联苯胺反应体系优化H2O2与联苯胺物质的量浓度比为3.0～5.0。

3 小结与讨论

植物过氧化物酶催化降解酚类有机物的实质是氧化耦合反应，能使带有酚或者苯胺官能团的化合物被氧化形成自由基或醌中间体，再通过共价键相互聚合，形成无定形的化合物[17，18]。目前关于不同植物过氧化物酶降解酚类有机污染物已有许多报道。林玲云[19]利用辣根过氧化物酶（HRP）催化氧化苯胺中间体乙醇胺（Monoethanolamine，MEA）的降解率可达到99%；Kurnik等[20]利用马铃薯过氧化物酶降解2，4-二氯苯酚的降解率达95%～98%；Ahmedi等[21]研究结果显示，过氧化物酶对刚果红（Congo red，CR）的催化降解率可达95%左右。以上结论均与本研究的最终降解率相接近。本研究中催化降解联苯胺的酶浓度试验的结果表明，在10 U/mL的酶浓度下，刺桐叶过氧化物酶对水环境中200 μmol/L联苯胺的3 h降解率可以达到100%，且反应后的溶液中剩余酶活并未出现明显下降，仍有利用价值。

不同植物来源过氧化物酶的性质以及降解的对象不同导致降解反应的最佳条件也不同。洪健等[22]研究发现，在15～80 ℃，厚朴过氧化物酶活性随着温度的升高而升高，热稳定性较好，具有较宽的温度适应范围。Kurnik等[23]发现，在10～60 ℃，马铃薯过氧化物酶对苯酚的降解率达97%。本研究中，刺桐过氧化物酶在25～45 ℃，可以保持催化降解联苯胺的良好效果，即该酶能够保持较好的温度适宜性。在温度为50 ℃时，该酶对联苯胺的催化降解率显著下降，说明该催化反应受温度影响较大，该酶耐高温性能较差。这可能是因为高温导致了酶的构象发生改变，对酚类化合物的降解率也不稳定。而此反应在室温下进行即可达到良好的效果，无需特别控制反应温度，这对其在工厂化应用方面很有利。

有研究显示，过氧化物酶在一个较宽的pH范围内都能保持较好的处理效果[24]，罗思强[25]研究过氧化物酶降解NP的pH优化试验表明，过高或过低的pH都会导致酶的催化效率降低；聂艳艳等[26]研究表明，氯过氧化物酶催化降解邻苯二胺的最佳pH为5，本研究中刺桐过氧化物酶降解联苯胺的最佳pH为7、8，对联苯胺的最终降解率均能达到100%，表明不同来源的过氧化物酶发挥作用的最佳pH不同。另一方面，在pH 3～7，pH越大，催化降解联苯胺的反应越迅速，降解率越高，这可能是由于pH的降低影响了底物和酶的解离程度，导致催化中间体的形成受阻，从而降低酶的活性，减慢了催化反应的速率。当pH为9时，联苯胺也不能被完全降解，这可能是由于溶液中的OH-逐渐增加会抑制H2O2分解过程中·OH的产生[27]，降低了氧化剂的浓度，减慢了催化反应速率并影响联苯胺的最终降解率。

赵广华等[28]研究不同浓度的H2O2催化降解双酚A试验结果表明，催化反应体系中H2O2与双酚A最适物质的量浓度比为5，在50 min内可以完全清除。在本研究中，刺桐叶过氧化物酶反应体系中H2O2与联苯胺物质的量浓度比为3.0～5.0时，可以完全清除，二者结果相近，其酶促降解反应的作用趋势是当联苯胺与H2O2摩尔比低于最适摩尔比时，酶对联苯胺的催化降解率随联苯胺与H2O2摩尔比增加而增加，当联苯胺与H2O2摩尔比高于最适摩尔比时，酶对联苯胺的催化降解率随联苯胺与H2O2摩尔比增加而降低。这可能是由过量的H2O2与有活性的酶中间物反应形成失活态造成的，类似于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）失活机理[29]。

综上所述，从刺桐叶片中提取到活性较高的过氧化物酶，该酶在pH 7～8，温度25～45 ℃，H2O2与联苯胺物质的量浓度比为3.0～5.0条件下，对联苯胺降解率可达100%，显示了刺桐叶过氧化物酶应用于酚类污染治理的潜力。

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