CYP2C19基因多态性与氯吡格雷对血小板聚集抑制作用的相关性研究

张 强

北京市顺义区医院检验科 101300

经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治疗急性冠脉综合征(Acute coronary syndromes，ACS)的有效治疗方式，而经PCI术后血栓和支架内血栓的形成是影响患者预后的重要危险因素。目前在PCI术前和术后使用氯吡格雷降低血小板聚集是预防PCI术后缺血事件发生的重要治疗手段[1-2]。患者服用氯吡格雷后在体内代谢成活性产物方能发挥抑制血小板聚集的药理作用。细胞色素酶P450家族在氯吡格雷代谢过程发挥重要作用，其中CYP2C19是其中重要一员。

氯吡格雷的临床疗效存在明显的个体差异，这种差异主要表现在氯吡格雷治疗相关的血小板高反应性(High on-clopidogrel treatment platelet reactivity, HTPR)，其发生与患者的遗传因素、代谢、依从性有关[3]。有研究认为CYP2C19基因多态性导致的对氯吡格雷代谢能力不同是引起HTPR的重要因素，但能否通过检测CYP2C19基因来预测服用氯吡格雷的临床疗效仍存争议。本研究通过测定服用氯吡格雷的患者基因型，分析其基因型与血栓弹力图测定的血小板ADP抑制率、MA值的相关性，从而为氯吡格雷的个性化治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 纳入2018年6月—2019年12月在我院心脏内科住院择期行PCI术的患者，选择其中214例服用氯吡格雷治疗的患者作为研究对象。口服氯吡格雷剂量75mg/d，所有入选患者均已排除患有严重肝肾功能损害疾病且血小板计数在(100～300)×109/L范围之内。

1.2 仪器与试剂 罗氏LightCycler 480型荧光PCR仪用于CYP2C19基因分型检测，试剂采用武汉友芝友医疗科技有限公司生产的人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒。美国Haemoscope TEG5000血栓弹力图分析仪用于测定患者血小板ADP抑制率。全血基因组DNA提取采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。

1.3 方法 收集经口服氯吡格雷抗血小板治疗5d后的患者血液标本，采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA·2K+)抗凝血标本用于CYP2C19基因分型检测。CYP2C19基因型测定采用PCR-荧光探针法。采用枸橼酸钠和肝素抗凝血标本用于血栓弹力图检测CYP2C19*2和*3突变及普通型患者208例的血小板ADP抑制率，使用Haemoscope公司的高岭土(含1%的kaolin液)，激活剂A(含蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢa因子)，和二磷酸腺苷(ADP)，分别检测高岭土、激活剂A和ADP通道的最大幅度(MA)，血液标本置于-20℃冰箱中冻存。

2 结果

2.1 CYP2C19基因型与等位基因频率的分布情况 所有测试人群的CYP2C19基因型分布情况为：*1/*2，70例(32.7%)；*2/*2，21例(9.8%)；*1/*3，12例(5.6%)；*2/*3，6例(2.8%)，在突变基因型中*1/*2出现频率最高，其出现频率表现为*1/*2>*2/*2>*1/*3>*2/*3。在CYP2C19基因型中*2突变位点的分布频率最高，为27.5%(118/428)。*3突变位点的分布频率次之，为4.2%(18/428)。*17突变位点的分布频率最低，为1.4%(6/428)。各突变位点出现频率和基因型分布频率均有统计学差异(P<0.05)。

2.2 不同CYP2C19基因代谢型的血小板ADP抑制率 根据 CYP2C19 的基因型不同，将*2、*3突变及未突变人群分为以CYP2C19的*1/*1型为对氯吡格雷的正常代谢型(NM)，*1/*2、*1/*3为中间代谢型(IM)，*2/*2、*2/*3为慢代谢型(PM)[4]。以ADP抑制率<30%作为发生氯吡格雷抵抗标准，30%～50%作为氯吡格雷达到治疗效果，>50%作为抑制效果明显治疗效果好。各基因型之间血小板ADP抑制率均存在显著差异(P<0.05)，见表1。

表1 不同水平血小板ADP抑制率在CYP2C19基因型内构成比[n(%)]

2.3 不同CYP2C19基因代谢型一般资料分析 对比三组不同CYP2C19基因型患者年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史及血脂异常史，差异均无统计学意义(P>0．05)，见表2。

表2 不同CYP2C19基因代谢型一般资料比较

2.4 不同CYP2C19基因代谢型患者的MA值比较 比较不同CYP2C19 基因代谢型患者的MA值，中间代谢型[(61.12±4.38)mm]和慢代谢型[(59.85±7.23)mm]患者的MA值显著高于正常代谢型[(59.85±7.23)mm],差异有统计学意义(F=69.66,P<0.000 1); 但慢代谢型患者的MA值与中间代谢型差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

随着人口老龄化的不断发展，冠心病及缺血性脑卒中发病率呈上升趋势，严重影响老年人的生存质量，给家庭和社会都带来了沉重的负担。目前为止，经皮冠状动脉介入治疗术仍是治疗ACS的主要方法。血小板激活、聚集与ACS的发生和PCI术后继发性心血管事件都密切相关，因此，ACS行PCI术后抗血小板药物的合理应用对其疗效及预后有着至关重要的作用[5]。

氯吡格雷是临床上广泛使用的抗血小板聚集药物，在预防和治疗心脑血管病的过程中发挥了重要作用。活性形式的氯吡格雷不可逆地与血小板表面的ADP受体P2Y12结合，对纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa受体的结合具有间接抑制作用，从而发挥不可逆的血小板聚集抑制作用[6]。随着氯吡格雷在临床的应用，研究发现部分服用常规剂量氯吡格雷患者的抗血小板功能检查存在抵抗现象，有缺血事件的发生。同时，还有研究表明，部分患者对氯吡格雷的反应性较高，有术后出血现象[7]。表现出明显的个体差异性。对于氯吡格雷抵抗，研究表明其受多方面因素的影响，其中基因多态性是一个重要原因。2010年美国食品药品监督管理局建议患者服用氯吡格雷前检测CYP2C19基因型，目前，已发现的CYP2C19基因突变至少有14种[8]。

在本研究中首先检测了214例服用氯吡格雷治疗的患者的CYP2C19基因型，发现*2突变位点的分布频率最高，为27.5%。*3突变位点的分布频率次之，为4.2%。*17突变位点的分布频率最低，为1.4%。这与文献报道中亚洲人CYP2C19*2频率(29%～35%)有略微的差别，但与报道的CYP2C19 * 3频率(2%～9%)相一致[9-10]。另外，笔者分析了患者的CYP2C19的突变基因型情况，发现其突变基因型频率为*1/*2>*2/*2>*1/*3>*2/*3。

接着使用血栓弹力图分析仪测定了本实验中CYP2C19 * 2和*3突变及普通型患者的血小板ADP抑制率，以ADP抑制率<30%作为发生氯吡格雷抵抗标准，30%～50%作为氯吡格雷达到治疗效果，>50%作为抑制效果明显治疗效果好。本研究实验结果发现正常代谢型血小板聚集率达到治疗效果的较中间代谢型及慢代谢型明显较多，且中间代谢型多于慢代谢型，差异均具有统计学意义。提示CYP2C19基因型可能影响氯吡格雷抗血小板疗效。CYP2C19*2和*3 等位基因的突变可能会影响氯吡格雷的抗血小板活性,且纯合突变的影响较杂合突变更为显著。此外，本研究还对不同CYP2C19基因代谢型的一般资料进行分析比较，发现不同代谢型之间年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、血脂异常史的差异无统计学意义。

血栓弹力图可以综合的、动态的反映体外血液凝固过程。MA为TEG参数中的最大振幅，表示血液样本中形成血凝块的最大强度和血凝块形成的稳定性，正常值为50～70mm。血小板及纤维蛋白原不同程度地影响MA值，其中血小板的影响更大，血小板质量或者数量的异常都会影响到MA值，MA值升高提示血凝块形成的强度增大。在本研究中对比了不同CYP2C19基因代谢型的MA值，结果显示，中间代谢型和慢代谢型患者的MA值显著高于正常代谢型,慢代谢型患者的MA值与中间代谢型无明显差异，提示中间代谢型和慢代谢型患者血凝块形成的强度增大，血栓形成风险可能增加，CYP2C19基因型可能影响血栓形成。

综上所述， CYP2C19 基因中间代谢型和慢代谢型患者氯吡格雷抵抗发生率较高，且中间代谢型和慢代谢型患者血凝块形成的强度增大，血栓形成风险可能增加。测定服用氯吡格雷患者的CYP2C19基因型，可为氯吡格雷的个性化治疗提供参考依据。由于本研究为单中心研究，且选取样本量较少,尚需要进一步加大样本量多中心研究进行验证。