不同静水压力对大鼠髁突软骨细胞FAS蛋白表达的影响

张红妤 孙 芳 肖 朋

1 新疆医科大学第七附属医院口腔科，新疆乌鲁木齐市 830028； 2 新疆医科大学第六附属医院口腔科

髁突软骨是骨化成骨的钥匙，是形成髁状突骨质的先决条件，研究髁突软骨在压力作用下的凋亡变化有助于解释髁突病变的机理。本课题拟研究髁突软骨细胞在一定的压力和时间范围内的凋亡情况，总结髁突软骨细胞在一定压力条件下的凋亡变化规律，分析临床中常见的关节盘移位以及正畸、修复治疗对髁突受力情况的影响，为临床如何促进髁突合理受力和避免髁突不良受力提供一些启示。

1 材料与方法

1.1 实验材料 磷酸酶抑制剂(碧云天)，RIPA裂解液(碧云天)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，SDS上样缓冲液(Amresco，国药集团化学试剂有限公司)，30%丙烯酰胺(Amresco)，TG[Biosharp，西格玛奥(上海)贸易有限公司]，蛋白marker(14～120kD，北京全氏金生物技术有限公司)，PVDF膜(0.45μM，Millipore)，兔抗GAPDH 37kD(杭州贤至生物有限公司)，兔抗FAS 48kD(Santa Cruz)，HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，ECL底物液(Thermo)，X光胶片(柯达)，显影定影试剂盒(武汉巴菲尔生物)。

1.2 细胞来源及分组、处理 取大鼠髁突软骨细胞第三代细胞[6]，首先按照加压时间分为1h、2h、4h三组，然后每组内按静水压力0kPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa随机分成6组，共计18组，其中0kPa为对照组，其余为实验组。分别按照相对应的实验压力条件和时间条件对各组进行加压处理，处理完毕后收集细胞备检。

1.3 加压设备及压力值 参考Koyama Y、Kunii R、Xiao E等[7-9]的压力值及加压方法，自制充气式加压装置。即向培养瓶内注入空气至压力表指针达到指定压强，立即移入培养孵箱并计时。

1.4 凋亡蛋白检测 以Western Blot法检测细胞FAS蛋白表达量。

1.4.1 制备蛋白样品。先提取单层贴壁细胞总蛋白，10倍稀释样品蛋白，制定BSA标准蛋白浓度，用DG-3022A酶标仪测定OD568。再根据BSA标准品和对应的OD值可计算出直线回归方程，根据样品蛋白OD值，通过回归方程测定蛋白样品的浓度。最后沸水浴10min使样品蛋白变性。

1.4.2 电泳及电转移。先配制电泳胶，再将样品蛋白和蛋白marker滴入上样孔，各样品总蛋白量为40μg，行电泳分离。最后以FAS-200mA 120min的转膜条件开始电转移。

1.4.3 免疫印迹显色：ECL显色系统。先将PVDF膜置于TBST溶液中，室温摇床封闭2h。用封闭液按 1∶200稀释一抗，浸泡PVDF膜过夜后洗去多余一抗。用封闭液按1∶50 000稀释相应的HRP标记羊抗兔二抗，浸泡PVDF膜2h后洗去多余二抗。滴入ECL试剂使PVDF膜显色，X 光胶片压片后常规冲洗胶片。

1.4.4 结果与分析。晾干胶片并扫描，用BandScan行灰度值分析，以抗大鼠GAPDH作为内参，FAS/GAPDH作为蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组FAS蛋白表达量 各组FAS蛋白表达量见表1。在同一时间分组内，随着静水压力的增加，FAS蛋白表达量呈先降低后上升的趋势；当静水压力为6kPa、8kPa、10kPa，实验组的FAS蛋白表达量均低于0kPa，差异有统计学意义(P<0.05)；当静水压力为30kPa时，不同时间分组的FAS蛋白量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；但在20kPa/1h、20kPa/2h分组时，实验组的蛋白量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白表达条带图见图1。

表1 不同时间不同压力值下MCCs的FAS/GAPDH蛋白表达情况比较

2.2 不同时间条件下细胞凋亡蛋白随压力变化情况 当压力在0～20kPa时，细胞凋亡水平基本呈先降低后逐渐回升至原始水平，细胞在此压力范围内表现为抑制凋亡，当压力在20～30kPa时，细胞凋亡程度则呈现为随压力和时间增加逐渐增长，表现为促进凋亡。见图2。

2.3 不同压力条件下细胞凋亡蛋白随时间变化情况 在受压时间1～2h内，压力值为10kPa时对细胞凋亡的抑制程度最大，在受压时间2～4h内，在30kPa、4h条件下促细胞凋亡作用最大。见图3。

3 讨论

适当的力学刺激是髁状突终生保持改建能力的生物学基础，对髁突软骨细胞的生物学反应意义十分重大。适度的力学刺激对保持正常的解剖结构、生理功能是必需的[10]。正常状态下的髁突软骨能够接受适当强度的压力，假若压力过大或时间过长，则可损伤关节软骨，受损程度与压力的强度、方式及受压时间有关[11]。颞下颌关节结构功能复杂，在临床中关节自身病变及正畸、修复治疗等都会对颞下颌关节髁突的受力造成影响。

关节盘移位是TMD中一种常见的关节结构紊乱性疾病，其临床患病率较高[12]。邹冰爽[13]通过对比观察面部不对称患者双侧颞下颌关节盘情况发现，有髁突发育障碍的偏斜侧关节盘形态和功能存在不同程度变化，前下移位者明显偏多，显示髁突发育不良的原因与关节盘移位有一定关系。另有学者[14-16]则报道不可复性盘前移位能妨碍关节盘正常活动，使髁突前斜面受压，破坏髁突骨质。韩建辉等[17]认为不可复性关节盘前移位患者患病时间越长，开口度越大，出现骨关节病可能性也越大。开口度越大，患者越用力张口，关节盘对髁突的压力越大，髁突受压更加严重。这一点也符合本研究总结的压力作用下软骨细胞凋亡的规律，即长时间较大压力作用下，细胞凋亡会增加，不利于髁突骨质改建。虽然目前没有学者明确报道不可复性关节盘挤压髁突的详细压力值，但推测这种挤压产生的压力值可能在20kPa以上。另外这种挤压产生的压力大小，可能会受到关节盘移位程度、移位方向、关节盘质地及关节囊松弛状态等诸多因素的影响，临床检测难度较大。这一点提示我们，在临床中应及早采取适当治疗措施，避免髁突受长时间挤压，尤其是在髁突表面软骨细胞层明显的生长发育阶段。

牙齿重度磨耗是老年口腔问题中的一种常见病，存在牙齿重度磨耗的老年患者中有部分存在明显的颞下颌关节紊乱病症状，但在咬合重建后患者颞下颌关节紊乱病的临床症状得到了明显好转[21]。牙齿重度磨耗后，髁突的位置发生了相应的调整，髁突向后上移位，关节后上间隙均较小[22-23]。患者出现颞下颌关节紊乱病症状的原因可能与髁突与其后上部位的软组织相互挤压有关，但目前未见牙齿重度磨耗与髁突骨质破坏之间存在明显相关性的报道。可能与老年人群中髁突表面以硬化皮质骨为主，软骨细胞少，压力对骨质影响较小有关。但髁突与其后上方软组织之间的互相挤压可能会引发炎症或刺激双板区感觉神经引发一系列临床症状。所以，从压力对细胞凋亡影响的规律来看，对重度磨耗患者及时进行咬合重建的修复治疗有利于髁突骨质的健康。

深覆颌患者常有口腔不良习惯，例如紧咬牙、夜磨牙等，常导致颞下颌关节区的骨质改变。多数学者认为其原因与关节内压力有关，Mori等[24]研究表明长时间压力作用下使颞下颌关节功能性过载，与关节退行性病变的发生有关。因此，对于深覆颌患者，破除口腔不良习惯对于颞下颌关节的保护至关重要。

FAS途径是软骨细胞凋亡的途径之一，FAS基因也是公认的凋亡活化基因，在凋亡活化阶段中发挥着重要作用，FAS及配体在髁突软骨细胞中的高表达，从而使FAS表达量成为检测细胞凋亡的指标之一[25]。本研究以检测FAS蛋白表达来反映软骨细胞凋亡的变化情况，虽然可能不能完全说明细胞凋亡的真实情况，具有一定片面性，但也足以说明一定问题。

综上所述，本研究所揭示的一定范围压力条件下细胞凋亡变化的规律可以较好地解释以上临床中常见的髁突受力改变而引起的骨质变化问题，为颞下颌关节髁突病变的机制提供了一些理论支持，为临床中如何从髁突受力因素避免髁突发生病变提供了一些启示。