PRRSV-2 NSP7 间接ELISA 检测方法的建立

赵孟孟，沙惠阳，张 航，黄良宗

（佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528225）

猪繁殖与呼吸综合征（俗称“蓝耳病”）于1975 年首次报道，随后世界流行，给养猪业造成了巨大的经济损失［1-3］。我国于1995 年首次报道［4］，2006 年爆发了以高致病性猪繁殖与呼吸综合征毒HPPRRSV 为主要病原的“高热症”。PRRSV 持续变异重组，近年来出现NADC-30 新型变异毒株，PRRSV存在ADE 效应［5］，入侵宿主之后在体内长时间存在，一直无有效疫苗药物。

PRRSV 基因组15 kb，属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒属（Arterivirus）。同属包括马动脉炎病毒（EAV）、鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）、猴出血热病毒（SHFV）［6-7］。该病毒基因组包含10 个开放阅读框（ORF）、ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7、ORF2b、ORF5a［8-11］。ORF1 编码复制酶进一步水解为16 个非结构蛋白（NSP1 α、NSP1 β、NSP2-6、NSP2N、NSP2TF、NSP7 α、NSP7 β、NSP8-12）。PRRSV 根据抗原差异分为PRRSV-1 和PRRSV-2 两种类型，我国主要流行PRRSV-2。

PRRSV NSP7 在不同毒株间高度保守，免疫原性好［11］，目前爱德士商品化PRRSV 抗体检测针对PRRSV N 蛋白，该方法不能完全反映其他蛋白抗体效价，存在假阳性问题。本文针对NSP7 建立检测方法，为进一步准确诊断和评估免疫效果奠定基础。

1 材料

病毒PRRSV-2 XH-GD 株本实验室保存。大肠杆菌DH5α、BL21、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、Ex Taq、Hind III、BamH I 购自Takara 公司；蛋白纯化Ni 柱购自GE Healthcare 公司；TMB、HRP 标记山羊抗猪IgG（H+L）、HRP-鼠抗猪IgG（H+L）、Western blot 发光液购自北京索莱宝生物科技有限公司。

2 方法

2.1 载体构建

以PRRSV XH-GD 全病毒cDNA 为模板，以NSP7-F 和NSP7-R 为引物，Ex Taq 酶扩增目的蛋白，凝胶纯化酶切连接pET-28a（+）载体。其中，引物5＇端为BamH I 酶切位点，3＇端 为Hind III 酶切位点，引物由广州天一辉远公司生物科技有限公司合成。上游引物序列：5＇-CGCGGATCCTCGCTGACTGG TGCCCTCG-3＇，下游引物序列：5＇-CCGAAGCTTTTCCCACTGAG CTCTTCTATTCTCG-3＇。

2.2 蛋白表达与纯化

2.2.1 时间梯度分析

将pET-28a-NSP7 转入BL21 表达菌，16 h 之后挑选目的菌落到含有卡那霉素的液体培养基，37 ℃培养至OD450值0.4～0.6，加1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养，每小时取1 mL 表达菌，表达菌进行SDS-PAGE 表达量分析。

2.2.2 可溶性分析

诱导表达100 mL 阳性菌，以1.0 mmol/L IPTG 诱导4 h，4 ℃12 000 r/min 离心15 min。加入5 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴超声裂解至悬浊液透亮（200 W，工作3 s/次，5 s 间隔）。完毕后4 ℃12 000 r/min 离心15 min，分离超声产物沉淀和上清，5 mL Binding Buffer 重悬沉淀。上清液和沉淀分别在沸水中加热15 min，之后进行SDS-PAGE 表达量分析。

2.2.3 表达蛋白纯化

蛋白纯化步骤参考GE Healthcare 公司Ni Sepharose 6 Fast Flow 使用说明书。

2.3 表达蛋白Western blot 验证

Western blot 参照文献［12］步骤，一抗为猪的阳性血清（本实验室保存），二抗HRP 标记1:10 000山羊抗猪IgG（H+L），ECL 化学发光显影。

2.4 间接ELISA 的建立

2.4.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

将重组纯化NSP7 抗原通过0.05 M 碳酸盐缓冲液配置不同浓度（10 μg/mL 至0.125 μg/mL），4 ℃包被酶标板16 h，每孔100 μL。加入5%脱脂乳封闭液，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h。按1:10 开始倍比血清，每孔100 μL。置37 ℃作用1 h 开展ELISA 方阵实验。将1:2 000 稀释后酶标二抗加入反应板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。TMD 底物加入反应板，每孔50 μL，置37 ℃作用1 h，在每孔加入50 μL 2 mol/L终止液终止反应。测定OD450值，计算得到最优包被浓度与血清稀释度。

2.4.2 工作条件的优化

根据上面结果包被酶标板配制不同封闭液：1% BSA（Bovine Serum Albumin）、0.1% BSA、5%脱脂奶粉、马血清。固定其他条件，一抗孵育时间设定0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 进行实验，确定一抗最佳作用时间。HRP-鼠抗猪IgG（H+L）以1：500，1：1 000，1：2 000，1：4 000 稀释，二抗孵育时间为30 min、60 min、90 min、120 min，测定二抗最优反应条件。显色时间分别为5 min、7.5 min、10 min、12.5 min、15 min，确定最佳显色时间。

2.4.3 阴阳性临界值确定与灵敏度、特异度分析

用本方法检测100 份（60 份阳性血清与40 份阴性血清）已知背景血清样品。测试换算成S/P 值，优化临界值（Cut off value）与灵敏度、特异度。规定S/P 值≥Cut off value 为阳性，S/P 值＜Cut off value 为阴性。Cut off value=（样品OD450-阴性对照OD450）/（阳性对照OD450-阴性对照OD450）。

2.4.4 特异性试验

用本方法检测背景明确的猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒等常见猪病血清，分析特异性。

2.4.5 敏感性试验

挑选5 份抗体效价不同阳性血清样品，参考1:100～1:6 400 进行稀释，检测稀释后OD450值，换算为S/P 值检测敏感性。

2.4.6 重复性试验

针对批内重复性试验，选取8 份抗体水平不同的猪血清分别进行测试，每份猪血清测定8 次，之后计算分析。批间重复实验通过4 个不同的时间点制备酶标版，分别测定8 份样品记录检测结果，开展数据分析。

2.4.7 临床血清样品比较

临床采集113 份未知血清，用本方法与IDEXX 试剂盒同时测定并比较差异。

3 结果与分析

3.1 原核表达质粒构建与鉴定结果

以PRRSV-2 XH-GD 株cDNA 为模板进行扩增，在770 bp 处有扩增片段，如图1 所示。

图1 NSP7 片段PCR 扩增结果

将重组质粒pET-28a-NSP7 进行PCR 鉴定，可见大小770 bp 片段，如图2 所示，表明重组质粒pET-28a-NSP7 构建成功。

图2 质粒PCR 鉴定结果

3.2 NSP7 诱导结果

通过SDS-PAGE 电泳分析，在36 kD 处出现蛋白条带，与预期大小一致，5 h 达到最高，如图3 所示。

图3 NSP7 诱导时间结果

细菌被诱导表达后超声裂解，结果表明NSP7 主要存在于上清中，如图4 所示。

图4 NSP7 的可溶性结果

3.3 Western blot 鉴定结果

将NSP7 蛋白转膜并鉴定，表明重组蛋白可被阳性血清识别，如图5 所示。

图5 NSP7 蛋白Western blot 结果

3.4 间接ELISA 条件优化结果

经方阵滴定实验与数据分析确定最佳蛋白包被浓度2 μg/mL，最佳一抗稀释度1:80，最佳封闭液5%脱脂乳，最佳封闭条件37 ℃封闭2 h，最适酶标二抗稀释浓度1:2 000，二抗工作时间37 ℃作用2 h，显色时间7.5 min。

3.5 临界值确定与灵敏度、特异度分析

将背景明确血清进行分析，结果表明临界值为0.11，灵敏度为99.1%，特异度为100%。

3.6 特异性试验结果

对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒进行检测，结果表明所检测全部阳性血清抗体OD450均小于临界值，说明本方法特异性良好。

3.7 敏感性试验结果

将标准血清和不同抗体水平血清进行1:800 倍稀释，检测结果仍为阳性，表明本方法敏感性良好。

3.8 重复性试验结果

结果表明批内系数小于5%，批间变异系数小于9%，表明本方法重复性良好。

3.9 与IDEXX 试剂盒分析结果

采集113 份猪血清，分别用本ELISA 方法和IDEXX 公司生产PRRSV ELISA 试剂盒检测，比较两者符合率，结果表明，本方法检出102 份阳性，IDEXX 试剂盒检出106 份阳性，95 份为双阳性，双阴性为7 份，符合率为96.2%。

4 讨论

PRRSV-2 对我国养猪业危害巨大，建立有效准确的检测方法对于及早发现和诊治该疾病具有重要意义。ELISA 方法因其准确、快速等优点而在兽医临床广泛应用［13-14］。

NSP7 在PRRSV 复制与免疫调控方面起着关键作用。研究表明，PRRSV 感染202 天，NSP1、NSP2、NSP7 保持高抗体水平表达，高于N 蛋白抗体水平［15］。NSP7 下调干扰素调节因子7，抑制下游干扰素刺激基因表达，逃逸抗病毒反应［16］。噬菌体展示方法在NSP7 鉴定出多个表位［17］。NSP7 与NSP9 互做［18-19］，NSP7 第153～162 位氨基酸存在线性表位NAWGDEDRLN［20］。NSP7 在不同毒株间高度保守，适于做血清学靶标，已建立免疫层析试纸［21］。

NSP7 抗体只在病毒复制过程出现，灭活疫苗产生针对N 蛋白抗体而不产生NSP7 抗体，弱毒疫苗或者野毒感染才产生包括NSP7 在内非结构蛋白抗体，以此区分灭活苗免疫和弱毒苗免疫。本研究基于此建立抗体检测方法，实验效果良好，NSP7 可被猪阳性血清识别，可用于临床检测PRRSV 抗体。以NSP7 为抗原建立ELISA 有以下优点：1）NSP7 蛋白可溶，有助于大规模建立诊断体系；2）NSP7 蛋白保守性较高，突变少；3）该蛋白感染过程可保持较长时间，且NSP7 抗体出现早，后期NSP7 抗体高于N 蛋白，灵敏度和特异度成为它的优点，有助于减少N 蛋白的假阳性结果。

本研究建立ELISA 诊断方法与商品化检测试剂盒符合率高、特异性好、重复性好，可用于检测NSP7 抗体效价。PRRSV NSP7 可溶性较好，方法建立成功。