玉米胚芽粕制备蛋白膜工艺优化及抗氧化研究

张金凤 王艳文 范恒军 张宇婷

(绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

玉米胚芽粕中含粗蛋白质18%～20%，粗脂肪1%～2%，粗纤维11%～12%。其氨基酸组成与玉米蛋白饲料(或称玉米麸质饲料)相似，属于饼粕类。因为玉米胚芽粕中的玉米蛋白很容易被提取出来，并且损失率极低。玉米胚芽粕中的蛋白质的利用及研究已成为国内外学者研究的方向和课题。玉米醇溶蛋白是由肽链主链上的羟基和亚氨基之间的氢键形成的蛋白质混合物，富含含硫氨基酸，蛋白质分子间通过强二硫键和水分散键连接，具有良好的成膜性能。作为一种可再生的天然高分子蛋白，玉米醇溶蛋白具有生物降解性和生物相容性。它一方面可以单独用作保鲜膜，另一方面也可以用作涂膜液，对果蔬的保鲜起到重要作用[1]。

目前，国内外对玉米醇溶蛋白膜的研究有很多：包括张雪娜等[2]利用超声波萃取玉米蛋白粉中的玉米醇溶蛋白，再制备玉米醇溶蛋白膜并测定其机械性能；刘婷婷等[3]利用超声波和微波制备了玉米醇溶蛋白—壳聚糖复合膜，得到了最佳工艺条件为超声功率180 W，微波温度50 ℃，协同作用时间6 min，搅拌速度300 r/min，制备的薄膜表面光滑，颗粒少；贾祥祥[4]以玉米醇溶蛋白为原料制备了蛋白质膜,通过单因素试验得到工艺条件再测性能指标；在此基础上作响应面试验得最佳工艺；曹思远等[5]以玉米醇溶蛋白为主要原料，以一定体积分数的乙醇为溶剂，甘油和油酸为增塑剂，研究了增塑剂用量、制备温度和挤出压力对玉米醇溶蛋白膜强度的影响；崔和平等[6]以玉米醇溶蛋白膜为原料制备蛋白质膜，加增塑剂和还原剂，通过单因素试验采取响应面优化得最佳工艺，以提高玉米醇溶蛋白膜的水溶性。

从前人研究现状可知，玉米醇溶蛋白膜原来仅限于玉米淀粉或者玉米蛋白粉，目前尚未有学者研究从玉米制油副产物玉米胚芽粕原料中提玉米醇溶蛋白制备蛋白膜。研究拟从玉米胚芽粉粕中提取玉米醇溶蛋白，加入一定量的增塑剂、还原剂改善玉米蛋白膜的性能不稳定性，深度加工形成质地均匀的、可降解的玉米醇溶蛋白膜，以期制备一种环保无污染可食用性包装膜。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米胚芽粕：河北石家庄华仁饲料有限公司；

皇冠梨：市售；

正己烷、亚硫酸钠、盐酸、无水乙醇、无水亚硫酸钠、丙三醇、氢氧化钾、无水氯化钙：分析纯，天津市光复科技发展有限公司；

离心机：80-2B型，湖南星科科学仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-6型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

电子分析天平：XS 365M型，上海衡平仪器表厂；

万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

超声波仪：KQ-50B型，昆山市超声仪器有限公司；

pH计：PHS-25(数显)型，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米胚芽粕提取玉米胚芽蛋白工艺 借鉴许英一等[7]玉米胚芽蛋白提取工艺的优化，将新鲜玉米胚芽粕经高速万能粉碎机粉碎后，室温下按m玉米胚芽粕∶V正己烷=1∶2 (g/mL)的比例加正己烷脱脂过夜，蒸发溶剂备用。脱脂玉米胚芽粉用崔立平[8]研究确定的200目为最佳破碎程度的检验过筛目数，用1 mol/L的NaOH溶液[料液比为1∶14 (g/mL)、pH调为9.5]在恒温水浴锅60 ℃的水温下加热60 min，冷却至室温，4 000 r/min离心20 min，离心后取上层清液，在其加入1 mol/L的HCl溶液(pH调为4.2)在恒温水浴锅60 ℃的水温下加热30 min，冷却至室温，4 000 r/min离心30 min，取沉淀，制得玉米蛋白，用考马斯亮蓝测定蛋白含量。

1.2.2 玉米醇溶蛋白膜的制备 取一定量的玉米蛋白溶于一定体积分数的乙醇溶液中，再加入一定比例的增塑剂和还原剂。在功率180 W，时间5 min超声辅助溶解，60 ℃恒温水浴反应30 min得到蛋白膜溶液[2-3]。取75 mL的成膜液，倒入玻璃板中流延，自然晾干接膜保存在相对潮湿的环境中等待后续试验备用。

1.2.3 膜性能的测定

(1) CO2透过率：在含有5 mL蒸馏水的试管中加入氢氧化钾直至饱和。用所制得的蛋白膜覆盖试管口处，用皮筋扎紧称重后置于空气中，每天称重两次，连续称5 d，以增加的重量计算二氧化碳透过率[9]。按式(1)计算CO2透过率。

PCO2=△m/(A×T)，

(1)

式中：

PCO2——二氧化碳透过速率，g/(m2·h)；

△m——锥形瓶的增加量，g；

A——膜的面积，m2；

T——测定时间间隔，h。

(2) 水溶性：根据文献[10]并修改，将蛋白质膜在75 ℃ 的干燥箱中干燥至恒重，准确称重后，放入装有50 mL蒸馏水的锥形瓶中，并将瓶口密封，防止灰尘进入和水蒸发。室温溶解3 h，将倒干水后的薄膜在105 ℃ 干燥至恒重，称重。根据蛋白质膜溶解前后的重量变化计算其水溶性。按式(2)计算水溶性。

w=(m1-m2)/m1×100%，

(2)

式中：

w——水溶性，%；

m1——溶解前样品的质量，g；

m2——溶解后样品的质量，g。

(3) 水蒸气透过率：参照李磊等[11]的拟杯子法。将取下来的薄膜密封在装有4 g无水氯化钙的锥形瓶中(需称量至恒重)，并将锥形瓶放置于(90±2)%相对湿度和(25±2) ℃温度下，定时从干燥器中取出并测量增重。按式(3)计算水蒸气透过率。

T=(W2-W1)/W1×100%，

(3)

式中：

T——水蒸气透过率，%；

W1——未吸水时小锥形瓶的初始重量，g；

W2——定时吸水后小锥形瓶的重量，g。

1.2.4 不同因素对玉米醇溶蛋白成膜的影响

(1) 丙三醇添加量对玉米醇溶蛋白膜性能的影响：分别准确称取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL)加入体积分数70%的乙醇，在超声波功率为180 W下，超声6 min后加入质量分数分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的无水亚硫酸钠，研究丙三醇添加量对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响。

(2) 乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白膜性能的影响：分别准确称取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL)加入乙醇体积分数分别为70%，75%，80%，85%，90%的乙醇，在超声波功率为180 W下，超声6 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的无水亚硫酸钠，研究乙醇体积分数对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响。

(3) 超声时间对玉米醇溶蛋白膜性能的影响：分别准确称取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL) 加入体积分数为70%的乙醇，在超声波清洗机功率为180 W下，分别超声4～8 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的无水亚硫酸钠，研究超声时间对玉米胚芽粕蛋白膜性能的影响。

(4) 水浴温度对玉米醇溶蛋白膜性能的影响：分别准确称取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL) 加入体积分数为70%的乙醇，在超声波清洗机功率为180 W下，超声6 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的无水亚硫酸钠，在恒温水浴锅水温分别为40，50，60，70，80 ℃下恒温水浴反应30 min，研究水浴温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响。

1.2.5 正交试验优化制膜条件 根据单因素试验结果，设计四因素三水平的正交试验进一步优化，得到最优的组合。

1.2.6 抗氧化活性研究 以褐变指数反映抗氧化活性。选用新鲜的市售皇冠梨，梨表面光滑、无伤痕/黑色斑点，把梨切成切片，按最优结果制备玉米胚芽粕醇溶蛋白膜液，成膜液立即涂抹在新鲜、无褐变、无霉变的切片上，室温平放放置6 h，每隔1 h观察梨切片的褐变情况并进行褐变指数测定，同时做涂膜空白对照试验。

褐变指数是由8名经验丰富的感官评价人员采用观察法评价和计算。褐变程度分为6个等级，分别以数字0、1、2、3、4、5来表示[12]，见表1。按式(4)计算每个样品的褐变指数。

表1 褐变程度对照表Table 1 Comparison table of degree of browning

IB=∑(PB×SN)/TNP，

(4)

式中：

IB——褐变指数；

PB——褐变级数；

SN——该级片数；

TNP——总片数。

2 结果与分析

2.1 丙三醇添加量对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响

由图1(a)可知，随着丙三醇含量的增加，蛋白质膜的水溶性先降低后升高，这是因为当丙三醇添加量极少时，丙三醇分子容易与蛋白质分子链的氨基酸残基和侧链基团形成氢键，阻碍了蛋白膜的吸水性。当甘油添加量达0.20 g/g 醇溶蛋白时蛋白膜水溶性最小，为24.96%。但是丙三醇含有亲水性羟基，丙三醇添加量增大时与醇溶蛋白发生反应，阻断疏水残留物，视蛋白结构展开，将埋藏的亲水区域暴露出来，所以蛋白膜的水溶性开始变得越来越大。

由图1(b)可知，随着丙三醇含量的增加，玉米醇溶蛋白膜的CO2透过率先降低后升高。丙三醇含量对CO2透过率的影响在一定范围内不显著，但随着丙三醇含量的增加，影响开始显著[13]。这是因为甘油用量少时，很难从环境中吸收水分，空间结构稳定，二氧化碳的传输速率小。随着甘油含量的增加，蛋白质分子间的羟基数目增加，从环境中吸收更多的水分子，导致膜空间连接处变得致密疏松，CO2透过性增加，膜阻隔性能恶化，当丙三醇添加量为0.2 g/g醇溶蛋白时，CO2通过膜的透过率最小，为0.28 g/(m2·h)。

由图1(c)可知，随着丙三醇添加量的逐渐增加，玉米醇溶蛋白膜的水蒸气透过率先下降后逐渐增加，当丙三醇添加量为0.2 g/g醇溶蛋白时，膜的水蒸气透过系数最小，为6.93 g·mm/(m2·d·kPa)。这是因为非极性基团的数量和分布的影响，丙三醇与玉米醇溶蛋白反应后，溶液极性周围发生变化。而在其他点膜的水蒸气透过率效果较差，这是因为丙三醇添加量较少时，醇溶蛋白空间结构稳定不被破坏，无法大量吸收水分。在添加量为0.5 g/g醇溶蛋白时，效果最差，这是因为丙三醇含有亲水性羟基，加入丙三醇后与醇溶蛋白发生反应，阻断疏水残留物，视蛋白结构展开，将埋藏的亲水区域暴露出来，所以吸水最多，水蒸气透过率最高。

图1 丙三醇添加量对玉米醇溶蛋白膜性能的影响Figure 1 Effect of glycerol addition on the performance of zein membrane

2.2 乙醇体积分数对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响

由图2(a)可知，随着乙醇体积分数的增加，蛋白质膜的水溶性也逐渐增加。在乙醇体积分数达到75%之前，有一个非常明显的上升趋势。当乙醇体积分数达到75%时，趋势趋于平缓，是因为乙醇体积分数越高，成膜液挥发越快，不利于蛋白质中氢键和S—S键的形成，导致蛋白质膜结构不够致密，分子间间隙较大，水溶性增大[14]。但此蛋白膜一般应用于蔬菜水果的保鲜上，因此蛋白膜的水溶性越小越好，综上，乙醇体积分数为70%时，蛋白膜的水溶性最小(21.67%)。

由图2(b)可知，蛋白膜的CO2透过率随乙醇体积分数的增加呈先减少再增多后平缓的趋势，这是由于一定体积分数的乙醇有助于提高蛋白分子间的相互作用，使其结构更致密，CO2透过率降低，但当乙醇体积分数突然增大时，阻碍了蛋白质分子间的作用，使其结构被干扰，故CO2透过率变大[15]。当乙醇体积分数为75%时，蛋白膜的CO2透过率最小，为0.26 g/(m2·h)。

由图2(c)可知，水蒸气透过率呈先下降后上升趋势，这是因为低浓度不利于玉米醇溶蛋白分子间的交联，玉米醇溶蛋白完全溶解，热组织，分子间隙小，可以形成均匀的网络结构，有效防止水蒸气的渗透。但过高的乙醇体积分数不利于分子流动，导致成膜不均匀、网格结构和间隙过大，进而导致水蒸气透过率的增加。乙醇体积分数为75%时，水蒸气透过率值最低，为6.36 g·mm/(m2·d·kPa)。

图2 乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白膜性能的影响Figure 2 Effect of ethanol concentration on the performance of zein membrane

2.3 超声时间对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响

由图3(a)可知，超声时间的不同对膜水溶性有显著性影响，且随超声时间的增大，膜的水溶性呈先减小后增加的趋势。这是由于超声波主要是以散发热量为主要形式，在这种环境下吸收能量，以此来提高水解反应速率，当超声时间较短时，会引起空化作用，导致部分底物被破坏，水解反应受到抑制，随着超声时间的增加，反应充分，蛋白分子需结合更多的水分子达到平衡，故水溶性又开始变大[16]。当超声时间为6 min时，膜的水溶性最小，为18.27%。

由图3(b)可知，随着超声时间的增加，蛋白质膜的CO2透过率先减小后增大，然后趋于平缓。这是因为适当的超声时间有助于改善蛋白质分子间的相互作用，使结构更加紧密，CO2透过率降低。但随着超声时间的增加，蛋白质分子间的相互作用受阻，结构受到干扰，CO2透过率增加。超声时间为6 min时，蛋白膜稳定，玉米醇溶蛋白膜的CO2透过率最小，为0.28 g/(m2·h)。

由图3(c)可知，超声时间的不同对膜水蒸气透过率有显著性影响，且随超声时间的增大，膜的水蒸气透过率先减小后增大。这是因为适当的超声时间有助于改善蛋白质分子间的相互作用，使其结构更加紧密，降低水蒸气的渗透性。但随着超声时间的增加，蛋白质分子间的相互作用受阻，结构受到干扰，水蒸气透过率增加。超声时间为6 min时，膜的水蒸气透过系数最小，为8.76 g·mm/(m2·d·kPa)。

图3 超声时间对玉米醇溶蛋白膜性能的影响Figure 3 Effect of ultrasound time on zein membrane performance

2.4 水浴温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影响

由图4(a)可知，随着水浴成膜温度的升高，玉米醇溶蛋白膜的水溶性先减小后增大。这可能是由于适当提高成膜温度改变了蛋白质的三维结构，分子中的疏水基团、—SH和疏水氨基酸侧链残基充分暴露，而蛋白质分子通过水分散键和S—S键的结合形成更紧密的蛋白质网络结构，从而降低膜的水溶性[17]。但当水浴温度达到一定值时，成膜液的流动性随温度的升高而增大，导致溶剂蒸发迅速，成膜时间缩短，反应不足。成膜分子在分子间有序交联形成相对规则的聚集状态之前，会过早沉积和固定，薄膜中的水分含量也会降低，会吸收外界的水分，造成水溶性变大。当水浴温度为60 ℃时，膜的水溶性最小，为19.64%。

由图4(b)可知，玉米醇溶蛋白膜CO2透过率随水浴时间的增加呈先减少再增多后平缓的趋势。这是由于适当提高水浴温度有助于水分和乙醇的蒸发，成膜液黏度下降，流动性增大，大分子聚合物片段移动加快，蛋白质分子通过疏水键、S—S键的结合形成比较严密、更紧凑的蛋白质网状结构，所以膜的CO2透过率会先降低，随着温度升高，蛋白开始明显变性，导致空间结构疏松，CO2透过率又开始增大。当水浴温度为60 ℃时，玉米醇溶蛋白膜的 CO2透过率最小，为0.39%。

由图4(c)可知，水浴温度的不同对膜水蒸气透过率有显著性影响，且随着水浴温度的增大，蛋白膜的水蒸气透过率呈先降后升的趋势。这可能是由于适当提高成膜温度改变了蛋白质的三维结构，使分子中的疏水基团、—SH 和疏水氨基酸侧链残基充分暴露，而蛋白质分子通过水分散键和S—S键的结合，形成更紧密的蛋白质网络结构，使膜的水蒸气透过率变小。随着水浴温度升高，蛋白开始明显变性，导致空间结构疏松，膜的水蒸气透过率又开始增大。当水浴温度为60 ℃时，膜的水蒸气透过系数最小，为7.68 g·mm/(m2·d·kPa)。

图4 水浴温度对玉米醇溶蛋白膜性能的影响Figure 4 Effect of water bath temperature on the performance of zein membrane

2.5 正交试验

正交试验因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal test

由表3可以看出，4种因素对玉米醇溶蛋白膜水溶性的影响顺序为A>C>D>B，对玉米醇溶蛋白膜水蒸气透过率的影响顺序为A>C>B>D，对玉米醇溶蛋白膜CO2透过率的影响顺序为A>C>B>D；通过正交试验确定A3B3C1D3为最优组合，即丙三醇添加量为0.3 g/g醇溶蛋白，乙醇体积分数为80%，超声时间为5 min，水浴温度为70 ℃。与正交表中的最优组合A3B2C1D3有差异，需要做一组(3个平行)验证实验确定最优组合，比较两个组合的3个性能见表3。验证实验得出，丙三醇添加量为0.3 g/g玉米蛋白，乙醇体积分数为80%，超声时间为5 min，水浴时间为70 ℃是最优的组合。

表3 正交试验结果分析表Table 3 Orthogonal test results analysis table

2.6 抗氧化活性

由图5可以看出，随着反应时间的延长，两组样品切片颜色都在逐渐加深。涂膜处理的样品切片褐变指数的上升速度明显低于涂膜空白组，可见玉米胚芽粕醇溶蛋白膜在食品保鲜上效果得到增加，褐变速度降低，能起到抗氧化护色的目的。

表4 组合A3B2C1D3与组合A3B3C1D3的比较Table 4 Comparison of combination A3B2C1D3 and combination A3B3C1D3

图5 褐变指数与反应时间的关系Figure 5 The relationship between browning index and reaction time

3 结论

玉米胚芽粕是玉米深加工的副产品，通常作为饲料使用，造成资源的过度浪费。其中，玉米胚芽粕的蛋白质含量约为18%～20%，与玉米胚芽基本一致。利用玉米胚芽粕为原料制备醇溶蛋白膜，以水溶性、CO2透过率以及水蒸气透过率为指标，通过单因素试验和正交试验研究4种因素对玉米胚芽粕蛋白膜性能的影响。结果表明：在丙三醇添加量为0.3 g/g醇溶蛋白、超声时间为5 min、乙醇体积分数为80%、水浴温度为70 ℃的条件下，玉米醇溶蛋白膜水溶性为19.75%、CO2透过率为0.21 g/(m2·h)、水蒸气透过率为6.13 g·mm/(m2·d·kPa)。在优化玉米醇溶蛋白膜制备工艺的基础上，对玉米醇溶蛋白膜的抗氧化性进行了研究，发现其具有一定的抗氧化保鲜效果。后续将进一步研究明胶、壳聚糖等物质对以玉米胚芽粕为原料制备的玉米醇溶蛋白膜稳定性的影响。