不同运动方式对肥胖大鼠肝脏脂质沉积及FGF21分泌的影响*

张 媛，盛 蕾，刘小玮，韦 娟，刘秀娟，张念云，王子艺

(1.南京体育学院运动健康学院，江苏 南京 210014；2.上海交通大学系统生物医学研究院运动转化医学中心，上海 200240；3.无锡惠山康复医院，江苏 无锡 214100)

我国肥胖人口已位居世界首位[1]。不合理饮食习惯(膳食结构)和不良生活方式(缺乏运动)是导致个体出现高血压、高血糖、高血脂和肥胖等疾病的危险因素。肥胖个体由于长期摄入热量过剩，脂肪合成过多并超过肝细胞的负荷能力，肝内脂肪的分解利用出现障碍，导致肝脏发生脂质沉积[2]。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是具有多种代谢功能的成纤维细胞生长因子家族中的一员，在调节碳水化合物和脂质代谢中起关键作用[3]，多项研究表明，FGF21可直接调节脂质代谢，减少肝脏脂质积累，被认为是治疗糖尿病、脂肪肝等代谢并发症的一个新靶点。诸多研究显示：不同运动方式可介导肝脏适应性改变，阻止体内脂肪过量累积，明显改善肝脏脂质代谢紊乱现象[1,4,5]。FGF21在运动改善肝脏脂肪代谢的过程中发挥何种作用目前尚不清楚，因此，本研究采用持续性运动(continuous exercise training,CT)和高强度间歇运动训练(high-intensity interval exercise training,HIIT)两种运动方式，探讨FGF21参与运动调节正常、肥胖大鼠肝脏脂肪代谢的作用机制，为运动防治慢病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件

SPF级4周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，购买于上海斯莱克实验动物有限公司。所有大鼠在室温20℃±5℃，相对湿度50%～60%条件下分笼饲养，自由饮食饮水。普通膳食饲料购买于南京市江宁区青龙山动物繁殖中心，高脂饲料购自Research Diets公司。

1.2 实验分组与肥胖造模

所有大鼠适应性喂养1周后，将大鼠随机分为两组，普通饲料喂养组(30只)和高脂饲料喂养组(30只)。高脂饲料采用Research Diets 公司45%高脂饲料(货号：D12451)，8周喂养后，以空腹条件下高脂饲料喂养大鼠平均体重超过普通饲料喂养大鼠平均体重20%时为大鼠肥胖造模成功[6]。造模成功后，将普通饲料喂养的正常鼠和高脂饲料喂养的肥胖大鼠随机分为正常安静组(LC)、正常高强度间歇运动训练组(LHI)、正常持续性运动训练组(LCT)、肥胖安静组(OC)、肥胖高强度间歇运动训练组(OHI)及肥胖持续性运动训练组(OCT)，每组10只，肥胖大鼠继续高脂饲料喂养。喂养过程中及时记录大鼠进食、饮水及生长情况，每周固定时间称测体重并记录。

1.3 运动训练方案

运动训练组大鼠进行为期8周负重游泳运动训练干预，玻璃泳池宽0.5 m、高0.6 m，水温31℃±1℃，每周训练5次，负重游泳采用大鼠尾部负重，按照标准称取一定重量金属片装在气球中系于尾部。CT组每天训练1次，每次30～60 min，HIIT组前4周每天训练5组，每组1 min，后4周每天训练14组，每组20 s，具体方案详见表1[7]。5-6周HIIT组负重超过体重10%，运动强度大，持续时间短，大鼠能够完成训练方案。游泳过程中，若大鼠出现运动协调性下降，反复下沉时，即刻捞出休息30 s，若大鼠在游泳过程中漂浮于水面不积极游动，则进行适当驱赶，以保证其运动质量。运动干预过程中，每天观察大鼠运动能力，恢复状况，检查身体是否带伤并做及时记录。

Tab. 1 High intensity interval training and continuous training protocol

1.4 实验标本取样

8周运动训练干预结束，各组大鼠禁食24 h后按30 mg/kg体重腹腔注射0.5%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血，装入采血管静置30 min后3 000 r/min离心5 min，上清即为血清，吸取血清转至冻存管-80℃冻存。断头处死，随后取新鲜肝脏放至生理盐水中润洗后称重，小心取肝组织，包裹OCT置于液氮速冻制作冰冻切片，剩余肝脏组织冻存管分装立即置于液氮速冻，后转移至-80℃冰箱保存待后续Western blot检测。

1.5 HE与油红O染色检测肝细胞形态及脂质含量

HE染色：1)取新鲜肝脏组织4%多聚甲醛固定并包埋，制作石蜡切片；2)切片下行梯度乙醇脱蜡，苏木精与伊红染色，树胶封片；3)镜下采集视野。油红O染色：1)新鲜肝脏组织OCT包裹后制作冰冻切片；2)切片入油红染液浸染，75%酒精稍分化，蒸馏水洗；3)苏木精复染,盐酸酒精快速分化1 s，蒸馏水洗；4)氨水水溶液返蓝,蒸馏水洗；5)甘油明胶封片,显微镜镜检。图像采集分析,其中脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞质为紫色，细胞核蓝色。

1.6 采用GPO-PAP法测定肝脏TG含量

各组大鼠取定量肝脏组织充分匀浆，无水乙醇提取匀浆介质，酶标仪测定吸光(OD)值，代入公式计算。

1.7 血清炎症因子、FGF21及肝脏脂代谢酶含量检测

采用ELISA法检测血清MCP-1、IL-1β、TNF-α及FGF21含量，检测肝脏组织LPL、FAT/CD36、CPT-1α、β-HAD酶含量。

1.8 Western blot法检测肝脏组织FGF21蛋白含量

1)肝脏组织蛋白提取；2)SDS-PAGE凝胶电泳配胶；3)上样；4)电泳；5)100 mv恒压转膜；6)5%脱脂奶粉封闭；7)4℃孵育一抗FGF21(1∶1 000，美国Abcam公司)、GAPDH(1∶5 000，美国proteintech公司)过夜；8)洗膜；9)二抗室温孵育60 min；10)洗膜；11)凝胶成像；12)Image Lab Software 5.2分析成像结果。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠体重变化

与正常大鼠相比，肥胖大鼠体重在8周干预期内均显著增高。8周HIIT和CT干预后，与LC组相比，LHI、LCT组体重显著降低(P<0.05)。与OC组比较，OHI、OCT组体重显著降低(P<0.01)，其中HIIT组体重降低幅度更大(表2)。

Tab. 2 Changes of body weight in rats ( g, n=10)

2.2 各组大鼠血清炎症因子含量

肝指数结果显示，与LC组相比，OC组肝指数显著增高(P<0.05)，OHI与OCT组肝指数在运动干预后显著降低(P<0.05)。与正常大鼠相比，肥胖大鼠血清中炎症因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量显著增高，经过8周HIIT和CT干预后均显著降低(P<0.05)，而8周运动训练干预对正常大鼠血清中MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量无显著影响(表3)。

2.3 各组大鼠肝脏组织脂质含量

肥胖大鼠肝脏组织HE染色较正常大鼠出现明显脂肪变形，细胞核形态异常，肝脏甘油三酯(TG)含量显著增高。油红染色显示，肥胖大鼠肝脏组织脂滴面积百分比较正常大鼠显著增加(P<0.05，图1，表4)。8周运动训练干预后，肥胖大鼠肝脏结构和组织学形态发生明显改善，TG含量及油红染色结果表明HIIT运动方式干预效果更加显著，其中肝组织TG含量LHI组与LC组相比下降35.8%，OHI组与OC组相比下降21.8%(表4)。

Tab. 3 The serum levels of MCP-1,IL-1β and TNF-α in rats of each group

Fig. 1 Oil red O staining of liver tissues in rats of each group(×400)

Tab. 4 Changes of liver Triglyceride content and fat droplet area by Oil red O staining in rats of each group n=8)

2.4 各组大鼠肝脏脂代谢酶含量

肥胖大鼠肝脏LPL、FAT/CD36酶含量较正常大鼠无显著变化，CT干预可提高正常、肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量。8周HIIT干预使正常、肥胖大鼠肝脏组织CPT-1α、β-HAD酶含量均显著增高，而CT干预对其调节无显著影响(表5)。

Tab. 5 Changes of liver lipid metabolic enzymes activity in rats of each group (U/g protein，

2.5 各组大鼠血清与肝脏FGF21水平

与正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平显著增高(表6)，肝脏FGF21蛋白含量显著下降(图2，表6)，8周运动训练干预使正常、肥胖大鼠血清、肝脏FGF21水平均增高，其中CT对肝脏FGF21蛋白含量的影响比HIIT显著(表6)。

Fig. 2 FGF21 relative protein amount changes in liver tissue of each group

Tab. 6 Changes of serum FGF21 level and liver FGF21 protein content in rats of each group n=8)

3 讨论

众所周知运动训练是降低肥胖个体体重的有效方式之一。持续性训练(CT)是较传统的运动训练方式，其可改变身体成分，提高心肺功能，降低血脂及胰岛素抵抗水平[8]，然而，近些年高强度间歇训练(HIIT)逐渐备受关注。研究发现，与CT相比，HIIT在代谢、心血管功能改善方面效果更佳，6周间歇性运动对肥胖大鼠体成分产生了良好的干预效果，且短时间高频率间歇性运动效果可能更好[9-11]。本实验研究发现CT对正常大鼠体重的影响较为显著，而HIIT对降低肥胖大鼠体重的效果更加明显。

研究证实超重和肥胖均是一种促炎症状态[12]：Selvaraju等人就正常体重和超重/肥胖儿童唾液肥胖标志物的水平与肥胖的关系以及这些标志物之间的相互关系进行研究，发现超重或肥胖个体唾液中MCP-1、TNF-α、IL-6、CRP水平均显著增高，而运动训练可促进骨骼肌分泌IL-6，进而刺激血液循环中抗炎症因子IL-1、IL-10增加，抑制促炎细胞因子TNF-α的生成[13]。本研究发现：与正常大鼠相比肥胖大鼠血清中炎症因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量均显著增高，说明肥胖与炎症反应具有较高的相关性，CT与HIIT均可显著降低肥胖大鼠血清炎症因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量，其中CT的抗炎效果比HIIT更加显著，同时研究发现不同运动训练方式对正常大鼠血清炎症因子水平无影响，可能由于正常大鼠机体炎症反应水平较低所致。

高脂膳食显著增加机体体重的同时常常会伴随肝脏组织脂质代谢异常，致使脂肪异位沉积，诱发非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)[14,15]。卢漫漫等人研究亦显示有氧运动可显著改善肥胖小鼠肝脏脂肪堆积及代谢紊乱[16]。高强度间歇性训练使肝内TG含量下降27%，同时降低机体脂肪含量及血清ALT、ASL水平。本研究发现与传统CT相比，HIIT对缓解肝脏脂肪沉积的干预效果更佳。研究表明：与正常个体相比，NAFLD患者肝脏和骨骼肌中脂肪酸转位酶CD36(FAT/CD36)蛋白表达水平显著增高[17]。脂蛋白脂肪酶(LPL)与FAT/CD36活性可调节循环脂肪酸代谢水平，本研究得出：与正常大鼠相比，肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量显著增高，CT运动训练对正常、肥胖大鼠LPL及FAT/CD36酶含量影响较显著，而HIIT对LPL及FAT/CD36酶含量无显著影响，可能是由于CT运动强度较低，对脂肪代谢的依赖性更高，因此对循环脂肪酸代谢水平调节作用显著。另一方面，Astorino等人报道HIIT可显著提高机体脂肪氧化水平，同时伴随羟酰辅酶A脱氢酶(β-HAD)、柠檬酸合成酶(CS)含量显著增高[17]。与其研究结果一致，本研究同样发现HIIT干预显著影响大鼠肝脏线粒体脂肪氧化酶含量，这与HIIT供能方式有关，即HIIT更依赖于糖代谢，血液循环中高水平脂肪酸输入肝脏较多，肝脏线粒体功能及脂肪酸氧化酶含量的提高促进肝脏脂质沉积的进一步改善[18,19]。

FGF21是成纤维细胞生长因子家族中特殊的一员，近期报道，FGF21是首个被发现的线粒体功能受损标志性因子，线粒体功能抑制将诱导活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)依赖性FGF21表达，从而改善饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗现象[20]。本研究发现，与正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平显著增高，而肝脏组织FGF21蛋白表达水平显著下降。与安静组大鼠相比，CT干预后使正常、肥胖大鼠血清、肝脏FGF21水平均显著增高，而HIIT对正常大鼠血清FGF21水平无显著影响。提示：不同运动方式均可上调肝脏FGF21表达水平，肥胖大鼠血清高水平FGF21为体内异常糖脂代谢产生的代偿效应，CT干预提高肥胖大鼠血清FGF21水平可作用于循环脂肪酸代谢，可能与提高周围组织对FGF21的敏感性有关。

综上所述，HIIT与CT两种运动方式均可缓解肥胖大鼠肝脏脂质沉积，但作用特点存在差异：HIIT使线粒体脂肪氧化酶含量显著提高，促进肝内TG氧化分解，对缓解肥胖大鼠肝脏脂质沉积效果显著，而CT可通过对血清、肝脏组织FGF21水平调节，增加参与肝脏摄取脂肪酸相关酶含量，对缓解肥胖大鼠肝脏脂质沉积效果有限。