春季角结膜炎患者眼表及角膜形态的改变*

张赛赛, 唐细兰, 洪满珠, 李东豪

暨南大学附属广州爱尔眼科医院综合科(广东广州 510400)

春季角结膜炎(vernal keratoconjunctivitis, VKC)属于过敏性结膜炎的一类，是Ⅰ型及Ⅳ型变态反应共同参与的眼表炎症，与季节性相关，常反复发作，以睑结膜的乳头增生和(或)角膜炎的胶冻样增生为主，常累及角膜[1-4]。过敏性眼病可以和干眼同时存在[5-7]，并相互影响[8-9]。此外，VKC患者常伴有角膜损害[10-11]。在临床中VKC的治疗主要集中在解除症状，对VKC引起干眼和角膜改变常常没有足够重视。有文献报道，VKC的治疗需要同时考虑干眼的诊断和治疗[12-13]，这对临床可能存在潜在的指导意义，还需要进一步的研究。本研究参照2017年 DEWS Ⅱ标准[14]，利用非侵入性眼表分析仪和活体共聚焦显微镜(in vivo confocal microscopy, IVCM)评估VKC患者的泪膜和角膜形态学变化，为阐明VKC的角膜病理变化及VKC与干眼的关系提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例组 选取2020年12月至2021年6月在暨南大学附属广州爱尔眼科医院符合诊断标准的VKC患者21例，所有患者为双眼受累。其中男13例，女8例；年龄12～36岁，平均(13.20±8.30)岁。

纳入标准：根据《我国过敏性结膜炎诊断和治疗专家共识(2018年)》诊断为双眼春季角结膜炎。

排除标准：(1)患有其他眼表疾病；(2)患有其他可能会影响泪液分泌的系统性疾病者(如Graves病、干燥综合征等)；(3)近半年内接受眼部手术操作者；(4)近半年内有眼外伤病史者；(5)近一个月佩戴角膜接触镜者；(6)全身使用免疫抑制剂或糖皮质激素者。

1.1.2 对照组 同期选取16例年龄和性别匹配的健康者作为对照组。其中男10例，女6例；年龄11～36岁，平均(12.78±9.67)岁。对照组与VKC组在年龄及性别构成比差异无统计学意义。排除全身性疾病、眼部活动性炎症、外伤史、眼部手术史、佩戴角膜接触镜史。

本研究中所有患者均由主治以上医师明确诊断。本研究经过暨南大学附属广州爱尔眼科医院伦理委员会批准(伦理审批编号：GZAIER2020IRB05)，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 临床检查

1.2.1 眼表检查 操作步骤：所有入组者在医师指导下完成OSDI干眼问卷填写。利用OCULUS非侵入性眼表综合分析仪(Keratograph 5M)对受试者进行眼部检测。嘱咐受试者将下颌置于仪器颌托上，双眼平视前方，待成功对焦后，眼表综合分析仪记录出眼表数据和图片。所有检查由同一医师检查3次，取中间值。所有检查遵循：先进行无刺激性检查，再进行刺激性检查。

观察项目：(1)泪河高度(non-invasive tear meniscus height，NITMH)：反映泪液的分泌量。正常值为：0.2～0.35 mm，高泪河≥0.35 mm，低泪河分<0.2 mm。(2)无创泪膜破裂时间(non-invasive keratograh breakup time，NIKBUT)：反映泪膜的稳态；正常值为：11～15 s，高标准为>15 s，低标准为<10 s。(3)睑板腺缺失分级评分：睑板腺体无缺失为0分；睑板腺体缺失面积<1/3为1分；1/3≤睑板腺体缺失面积<2/3为2分，睑板腺体缺失面积≥2/3为3分。上下睑得分相加为受检眼的最终得分。(4)角膜荧光染色(CFS):角膜被划分为4个象限。每个象限按0～3分进行评分。0分：无点状染色；1分：染色不足一半；2分：染色大于一半；3分：全染色。每个象限的评分进行加和获得总分。(5)眼红分析：将检测仪调焦至结膜血管最清晰的位置，采集数据。所采集的数据经R-scan软件分析后即可显示出量化的结膜充血评分数值。

1.2.2 IVCM检查 操作步骤：采用海德堡HRT3-CM共焦激光显微镜进行角膜形态的观察。机器参数：激光波长670 nm,观察视野为400 μm×400 μm，轴向分辨率为1 μm。对受试者进行眼表麻醉(盐酸丙美卡因滴眼液，美国Alcon公司)。受试者将下颌放进设备的下颌托处，前额固定于前额托，调节CCD摄像头的位置，使CCD摄像头的光轴与激光扫描摄像头的光轴垂直。嘱患者注视指示灯，将摄像头移向患者，直到患者角膜与Rostock角膜接触帽的距离在5～10 ms之间。调整物镜位置，使角膜接触帽与受试者角膜中央轻微接触。所有操作由同一医师完成。

观察项目：(1)朗格汉斯细胞密度：利用IVCM内置的细胞计数软件计算中央角膜上皮内浸润的朗格汉斯细胞密度；(2)角膜神经：利用IVCM 结合Image J 软件对中央角膜上皮下神经丛进行计算和分析；(3)睑板腺观察：利用IVCM对睑板腺进行扫描，观察睑板腺腺泡密度和腺泡长径。

1.3 统计学方法 利用Image J软件对图像进行分析及处理，采用SPSS 16.0进行统计学分析，数据资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。对于率或构成比比较采用2检验；对于连续变量结果，用 Pearson相关分析检验相关性。P<0.05(双侧)被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼表检测结果 病例组与对照组眼表检查结果比较显示，多数的VKC患者符合TFOS DEWS Ⅱ干眼诊断标准(53%vs.21%，P=0.028)。病例组患者OSDI评分明显高于对照组[(29.10±18.72)分vs.(8.36±5.17)分，P<0.001]，见表1。病例组的NITMH较对照组偏低，差异有统计学意义[(0.19±0.06)mmvs.(0.25±0.08)mm，P=0.029]，见表1。病例组的NIKBUT比对照组偏低，差异有统计学意义[(8.15±1.74)svs.(11.04±1.87)s,P=0.003]，见表1,图1。病例组的睑板腺缺失评分较对照组更高[(2.00±0.43)分vs.(0.56±0.49)分，P<0.001]，见图2。病例组的角膜荧光染色评分较对照组更高，差异有统计学意义[(1.30±1.18)分vs.(0.36±0.19)分，P=0.031]。眼红分析检查结果病例组的数值较对照组明显升高，差异有统计学意义[(1.07±0.50)分vs.(0.55±0.16)分,P<0.001]，见表1。

表1 病例组与对照组眼表检查结果

注：显示VKC患者的NIKBUT偏低，提示泪膜稳定性差

注：显示VKC患者的睑板腺缺失面积更大

2.2 IVCM检测结果 IVCM显示病例组睑板腺腺泡萎缩、腺泡排列欠整齐、腺泡周边炎症细胞浸润，腺泡不规则膨大(图3-A、B、C)。两组睑板腺活体共聚焦显微镜分析结果显示，VKC患者的睑板腺腺泡密度较对照组减少，差异有统计学意义(P=0.049)。此外，VKC患者的腺泡长径、腺泡短径、腺泡周边炎症细胞密度分别与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 两组睑板腺活体共聚焦显微镜分析结果比较

IVCM显示大部分VKC患者的角膜上皮最表层的鳞状细胞消失，仅可见基质层细胞(图3-D)；同时，VKC患者角膜上皮下可见大量朗格汉斯细胞浸润(图3-E)，较对照组明显增多，差异有统计学意义(P<0.001)。IVCM显示VKC患者的角膜上皮下神经丛密度降低，神经纤维变细，弯曲度增加(图3-F)。统计分析结果显示：VKC患者的朗格汉斯细胞密度、中央角膜神经密度及角膜神经直径与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

注：A:睑结膜可见大量炎性细胞浸润; B:睑板腺腺泡周围可见大量炎性细胞浸润; C:睑板腺腺泡膨大，呈现不规则; D:角膜上皮最表层的鳞状细胞消失; E:睑结膜可见大量朗格汉斯细胞浸润; F:角膜神经丛密度下降，神经纤维变细及弯曲度增加

表3 两组角膜上皮下朗格汉斯细胞及神经丛活体共聚焦显微镜分析结果比较

2.3 相关性分析 对睑板腺腺泡密度和腺泡长径这两项检测的各个指标进行相关性分析，结果显示，中央角膜神经密度与睑板腺腺泡密度呈正相关(R2=0.197，P=0.044)，与腺泡长径呈负相关(R2=0.46，P<0.001)。见图4～5。

图4 中央角膜神经密度与睑板腺腺泡密度的关系

图5 中央角膜神经密度与腺泡长径的关系

3 讨论

VKC是Ⅰ型及Ⅳ型变态反应共同参与的眼表炎症，以睑结膜的乳头增生或角膜缘的胶冻样增生为主要表现，常可累及角膜[1]，全球过敏性结膜炎患病率约为10%[13]。VKC常会影响到患者的生活质量和工作，目前VKC的诊断包括症状体征评估和实验室辅助检查，检查方法包括结膜刮片细胞检查，泪液或血液IgE抗体检测，过敏原应激实验等[15-16]。尽管这些检查对VKC诊断有较高的特异性，但是并未对VKC患者的眼表及角膜进行全面评估。本研究参照DESWⅡ推荐的干眼诊断方法和流程，从泪膜和角膜形态改变为出发点，阐述VKC与干眼的关系以及VKC患者的角膜病理学改变。

有研究显示，眼表屏障的完整性是维持免疫平衡的结构基础[17]。外界过敏原若要与结膜的免疫细胞发生反应，就必须穿过结膜上皮达到黏膜下。VKC常伴随着眼表细胞质因子和炎症介质的过度释放，并且促进角膜基质层纤维细胞释放趋化因子和黏附分子，如组胺，IL-4，TNF-α等，进而加重过敏反应[18]。这些可以导致结膜杯状细胞及角膜上皮细胞损伤，进而合并眼表屏障的损害并加速免疫反应过程[19]。本研究通过IVCM观察到16例VKC患者角膜上皮最表层的高亮鳞状细胞消失，提示VKC患者的眼表屏障受损。这种上皮细胞的异常形态可能会加速外界致敏原与眼表的免疫细胞的反应。

VKC的发病过程是多种机制破坏眼表免疫的综合作用过程，其中炎症因子起到重要作用。TNF-α和IL-1激活树突状抗原递呈细胞，促进细胞产生活化分子，包括MHC Ⅱ抗原、VEGFr3等[19-21]。本研究通过IVCM发现VKC患者角膜上皮下可见大量朗格汉斯细胞浸润，较对照组明显增多，差异有统计学意义(P<0.001)，这也验证了VKC患者角膜存在免疫炎症反应。朗格汉斯细胞属于树突细胞群体，是免疫反应中主要的抗原呈递细胞。朗格汉斯细胞将外界抗原呈递给T淋巴细胞，参与了VKC的病理过程。以往，在活体很难对朗格汉斯细胞进行观察，IVCM的应用为我们在活体观察VKC角膜组织病理变化提供了可能性，并为阐述病理过程提供了依据。

VKC患者常合并干眼，Kumar 等[5]报道了春季为过敏性结膜炎发生的高峰，3、4月份同为干眼诊断的季节性高峰，从另一个侧面说明，这两者可能有着较密切的关系。Hom 等[7]在他们的研究中报告了57.7%的过敏性结膜炎的患者合并干眼，45.3%的干眼患者有眼痒症状。我们的研究显示，VKC组的睑板腺缺失评分较对照组更高(P<0.001)，眼表屏障的泪膜稳定性的改变可能也参与了VKC的病程。

本研究参照2017年DEWS Ⅱ标准，采用Keratograph 5M对患者进行眼表分析，结果显示VKC患者泪河、BUT较正常人明显降低，角膜荧光染色评分较正常人增加，VKC患者睑板腺缺失较正常人增加。这些评价干眼的重要指标都表明了VKC患者合并泪膜稳定性下降；IVCM结果也显示睑板腺腺泡密度下降、腺泡间质炎症细胞浸润。此外，本研究通过IVCM对患者的角膜神经丛进行观察，VKC患者与正常人相比，角膜上皮下神经纤维细且密度下降，同时神经弯曲度明显增加，中央角膜神经密度与睑板腺腺泡密度呈正相关，与腺泡长径呈负相关。新的DEWS Ⅱ干眼指南指出，神经知觉的改变是导致干眼的重要因素。正常人通过反射性泪液和瞬目过程，可以将眼球表面的有害物质(包括致敏物质)清除[22-23]。结合本研究结果，我们认为VKC患者角膜神经纤维的改变，导致反射性泪液的减少，进而减缓了有害物质的清除，加速了VKC的过程。睑板腺的宏观和微观的共同改变说明了，睑板腺功能的异常参与了VKC的干眼进程[24]。这可能提示我们随着病情的发展，VKC患者可能表现为混合型干眼。

利益相关声明：所有作者一致声明无利益冲突存在。

作者贡献说明：张赛赛直接参与酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析解释数据并起草论文与统计分析。李东豪对论文的知识性内容作批评性审阅，技术或材料支持，指导，支持性贡献。唐细兰直接参与分析解释数据并指导。洪满珠指导工作。