基于网络药理学及分子对接技术探讨白芍治疗早发性卵巢功能不全的作用机制

陆岩， 黄旭春， 曹晓静， 王小云

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405；2.广东省中医院，广东广州 510120）

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）又称为卵巢早衰，是指女性在40 岁之前卵巢活动衰退的临床综合征，以月经紊乱（如停经或稀发月经）伴有高促性腺激素和低雌激素为特征。有调查表明，我国女性的POI发病率为2.8%，呈现逐年升高趋势，并有向低龄化发展的势态[1-3]。西医治疗以激素替代疗法（HRT）为主，可改善低雌激素症状、预防远期并发症。尽管HRT 临床疗效肯定，但有研究指出长期使用HRT 将增加乳腺癌、中风和心血管疾病等的发病风险[4]。中医药在改善月经异常及女性生殖能力方面取得了良好疗效，且安全、副作用少[5]。其中，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，有养血调经、敛阴止痛、平抑肝阳之功效，主治血虚萎黄、月经不调等病证[6]。医家张锡纯《医学衷中参西录》中累计使用药物频次，白芍居于首位[7]。POI 用药规律的研究结果显示，白芍为常用高频药物[8-9]。网络药理学是一门在系统层面揭示中药对机体调控网络作用的学科，内容涉及多向药理学、系统生物学、网络分析等多个学科领域，通过网络在线数据库检索、计算机软件等构建“化合物-基因-疾病”相互作用网络图，系统诠释药物与疾病间的关联性，为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[10-11]。其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合。为临床应用白芍治疗POI提供证据，本研究基于网络药理学及分子对接技术进一步探讨白芍多成分、多靶点、多通路的协同作用治疗POI的机制，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1. 1白芍活性成分的筛选以“白芍”为关键词，通过中药系统药理学分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）检索，获取白芍的主要活性成分。因中药多为口服制剂，故以药代动力学参数（ADME）为依据，设置药物口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似度（DL）≥0.18，筛选出活性成分。结合文献研究[12-14]挖掘，最终确定白芍的主要活性成分。

1.2 白芍活性成分作用靶标的筛选应用TCMSP数据库中的“靶点预测”功能，预测白芍活性成分的作用靶标。再利用perl 软件（http://www.perl.org/）对收集的化学成分及作用靶标添加基因名。

1.3 POI疾病靶标的获取与收集GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）是一个分析人类基因数据的综合数据库；在线“人类孟德尔遗传”数据库（OMIM，Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）记录了所有已知疾病的遗传成分，并可以预测它们与人类基因组中相关基因的关系。将“Premature Ovarian Insufficiency”输入GeneCards 与OMIM 数据库中检索获取与POI 相关的靶标，并去除重复部分。然后运用R软件（https://www.rproject.org/）将与白芍有效成分相关的靶标和疾病靶标取交集，获得白芍活性成分治疗POI的靶标，并绘制韦恩（Venn）图。

1.4 药物-成分-靶标-疾病网络的构建将白芍活性成分所对应的靶标和POI 相关的靶标取交集，获得的靶标即为白芍治疗POI 的关键靶标。使用Cytoscape 3.7.2 软件（http://www.cytoscape.org）构建“药物-成分-靶标-疾病”关系网络。网络中的“节点”代表白芍药物、有效成分与关键靶标；“边”代表药物-成分、成分-靶标、靶标-疾病之间的连接。整个网络展示了药物-成分-靶标-疾病之间的联系，通过这一网络可以深入分析白芍治疗POI 的作用机制。以网络节点度（degree）值和中介中心度（betweenness centrality）为筛选条件，挖掘网络核心节点。

1. 5靶标蛋白相互作用（PPI）的网络构建使用STRING 数据库（https://string-db.org）预测蛋白质之间的相互作用。选择“Multiple Proteins”功能，选择“物种”为人类（Homo Sapiens），将白芍治疗POI 的关键靶标导入数据库进行检索，即可构建PPI 网络。STRING 数据库系统还可以对预测结果进行评分，分值越高，表示PPI 结果的置信度越高。本研究设定评分分值＞0.40，获得节点度值等反映靶点之间相互关系的信息。

1.6 关键靶标的生物功能注释与通路分析先用perl软件将白芍治疗POI的关键靶点名称转换成entrez ID，然后进入Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）找到R 软件。Bioconductor 是目前最常用的高通量基因组数据分析工具之一，它以R 软件为平台提供了19个物种（含人类）的基因本体论（GO）注释信息。ClusterProfiler是基因数据分析的R语言工具之一，结合entrez ID，得到GO 注释信息和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集信息。运用上述工具，以P＜0.05为条件，进行信号通路富集分析及结果可视化。

1.7 分子对接根据网络构建的拓扑结果，用分子对接模拟研究配体在复杂分子网络中的潜在相互作用。从RCSB数据平台（PDB，www.rcsb.org）检索PPI 网络中核心靶标的3D 结构PDB 格式文件。再从ZINC 数据库（http://zinc.docking.org）下载网络图中度值居前列的药效分子的Mol2 格式文件。采用Autodock 进行核心成分与核心靶标间的分子对接验证。利用结合能来评估分子与靶点的结合能力，结合能＜0 表明能自发结合，结合能≤-5 kcal/mol表明结合良好。

2 结果

2.1 白芍活性化合物的筛选分析通过TCMSP数据库检索到白芍有效成分85 个，以OB ≥30%和DL ≥0.18为条件进一步筛选出13个有效成分，主要成分为芍药苷、芍药苷元酮、桦木酸、β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、儿茶素、苯甲酰芍药苷等，结果见表1。

表1 白芍主要活性成分及其口服生物利用度（OB）和药物相似度（DL）值Table 1 Active components of Radix Paeoniae Alba and their OB and DL values

2.2 白芍成分治疗POI的潜在作用靶点预测通过TCMSP 数据库预测白芍的主要活性成分作用靶标，除重后共获得62 个靶标。Gene Cards 数据库收集疾病靶标2 718 个，OMIM 数据库收集疾病靶标166个，整合数据库检索结果并去除重复基因后共获取POI 相关基因靶标2 809 个。运行R 语言“VennDiagram”程序包将白芍有效成分相关的靶标与POI相关靶标取交集，获得白芍活性成分治疗POI的靶标，并绘制韦恩（Venn）图。结果显示白芍对POI 可能起到作用的靶标共35 个，表明白芍是通过多个靶点发挥治疗POI作用的。

2. 3白芍-成分-靶标-POI网络构建应用Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-有效成分-靶标-疾病”相互作用的网络图，见图1。该网络由44个节点组成，包括7 个成分节点、35 个靶标基因节点、1 个药物节点及1 个疾病节点。绿色代表疾病，红色代表药物，黄色节点代表白芍的主要有效成分，蓝色节点代表作用靶标。

图1 白芍治疗POI的药物-成分-靶标-疾病网络Figure 1 Drug-component-target-disease network of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

网络节点度值和接近中心度反映了网络中节点核心度的高低，度值越高，表明该节点越重要。将度值和中介中心度值按大小排序筛选核心成分和靶点，结果显示，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、（+）-catechin（儿茶素）等白芍有效成分以及PGR（孕激素受体）、PTGS1（前列腺素G/H 合酶和环氧合酶）、NR3C2（盐皮质激素受体基因）等作用靶标是网络的核心节点，提示这些节点是白芍治疗POI 的关键有效成分或靶标。具体结果见表2。

表2 白芍-成分-靶标-POI网络关键节点Table 2 Key nodes in Radix Paeoniae Albacomponent-target-POI network

2. 4白芍治疗POI的关键靶标PPI网络分析结果进入STRING数据库，上传白芍活性成分治疗POI 的靶标，将置信度评分设定为分值＞0.40，去除游离于网络之外的蛋白，得到白芍活性成分对应的靶标PPI 网络，见图2。该网络共包含节点35 个，边153 条，平均度值为8.74。边数越多表示该节点对应的靶标在网络中的作用越重要。运用R 语言抽取网络中的关键靶标的信息条形图，见图3。IL-6（白细胞介素6）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、MAPK8（丝裂原激活蛋白激酶8）、RELA（核转录因子Rel A）、ESR1（雌激素受体1）是关联度值最大的前5个节点，这5个节点可能是白芍治疗POI 的重要靶标。其中IL-6 关联度最大，有研究表明，卵泡液内有较高水平的IL-6，其与雌二醇（E2）产生及卵母细胞成熟度有一定关系[15]。

图2 白芍治疗早发性卵巢功能不全（POI）关键靶标的PPI网络Figure 2 PPI of core target genes of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

图3 白芍治疗早发性卵巢功能不全（POI）的PPI核心靶标基因Figure 3 Core target genes in PPI of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

2.5 关键靶标生物功能及通路分析将白芍可能对POI发挥作用的靶标导入软件R×64 3.6.2，进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。GO功能富集共获得59 条目，根据P值大小进行排序，选取前20 个条目展示，见图4。结果显示白芍治疗POI 的关键靶标主要富集在核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性（transcription factor activity），直接配体调控特异性DNA 结合（direct ligand regulated sequence-specific DNA binding），类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）等。

图4 白芍治疗早发性卵巢功能不全（POI）靶标的GO功能富集Figure 4 GO enrichment in POI targets treated by Radix Paeoniae Alba

KEGG 通路富集结果共得到85 条通路，24 条信号通路，主要包含免疫炎症相关通路、细胞信号转导途径、代谢相关通路、癌症相关通路、细胞发展过程相关通路、传染病相关通路等，见图5。KEGG 通路富集分析结果显示，晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）是最为显著的信号通路，可能是白芍治疗POI 重要的信号通路。其他起作用的信号通路还包括IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等。表明白芍的有效成分是通过调控多种生物学途径发挥治疗POI作用的。

图5 白芍治疗POI关键靶标KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway Enrichment analysis of key targets in POI treated by Radix Paeoniae Alba

2.6 分子对接选择网络核心成分山柰酚与PGR进行分子对接。通过Pymol 软件进行可视化，从图6-A1～A2可以清楚地看出，山柰酚与PGR 不会形成氢键。山柰酚与PGR 的结合能为-6.41。在图6-B1～B2中，山柰酚与PTGS1 的分子对接结果表明，山柰酚与ATP 竞争PTGS1 的结合位点，并通过与相应骨架的氨基和羰基形成氢键而紧密结合残基（Asn-382，His-388，Ala-199）。山柰酚与PTGS1 的结合能为-7.64。在图6-C1～C2中，山柰酚与NR3C2 的分子对接结果表明，两者通过与相应残基的主链氨基和羰基形成氢键而与NR3C2 紧密 结 合（Leu-938，Ser-810， ARG-817，Asn-770）。山柰酚与NR3C2 的结合能为-7.46。这些结果证明，山柰酚和PTGS1、NR3C2对接结果良好。

图6 山柰酚与PGR、PTGS1、NR3C2的分子对接结果Figure 6 Molecular docking results of kaempferol and PGR，PTGS1 and NR3C2

3 讨论

中医古代文献中没有早发性卵巢功能不全（POI）的病名，根据其主要临床症状，可归属于“血枯”“经闭”“月经过少”“经水早断”等范畴。POI患者多为先天不足，加之后天失养，久病损耗或金刃损伤等引起精血耗竭，冲任亏损，机体常年处于“阴血不足”的状态，故肝体失养而疏泄失常，肝气郁结。然而“女子以血为用”，阴阳失衡，气血不调，往往最先出现卵巢功能减退。白芍具有养血调经、敛阴柔肝的功效。既往药理研究显示，白芍具有抗炎、免疫调节、镇静、抗抑郁、抗惊厥、解热、解痉、护肝、扩张血管、耐缺氧等作用[16-17]。有研究报道，白芍及其配伍能调整血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、促卵泡生成激素（FSH）的紊乱[18]，以白芍为君药的养阴舒肝颗粒可以缓解模型小鼠的肝郁状态[19]，可以改善卵巢的功能[20]。

本研究运用TCMSP 数据库筛选出13 个白芍潜在有效成分，根据拓扑出的关键节点，山柰酚、β-谷甾醇及儿茶素是白芍作用于POI的主要3个成分。其中：β-谷甾醇为萜类，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[21]；山柰酚为黄酮类，具有抗炎、抗氧化、护肝等作用[22]；儿茶素为酚类，具有抗炎、抗癌等作用[23]。高静[24]发现POI 患者外周血辅助性T1 细胞比例明显增加，宗国霞等[25]也发现POI患者外周血T淋巴细胞亚群CD3+显著升高；而慕静静等[26]研究发现，山柰酚能显著抑制小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖。曾莉萍等[27]发现，β-谷甾醇能明显促进卵巢颗粒细胞分泌E2，而POI患者临床表现为雌激素水平波动性下降。研究发现，卵母细胞减少或成熟障碍会降低卵巢的储备功能，加快卵巢早衰的发展[28]，而表儿茶素是儿茶素的一种，可提高小鼠卵母细胞的数量及其发育潜能[29]。故本研究预测白芍通过山柰酚、β-谷甾醇、儿茶素等有效成分改善POI。

从拓扑出的关键节点来看，PGR、PTGS1、NR3C2 等既是POI 靶标又是白芍活性成分预测靶标。PGR 属于甾体激素核受体家族，可结合孕激素发挥生理功能，在动物的发育、生殖中起着十分重要的作用[30]；且有研究表明PGR 调节因子在卵巢组织内相互协调作用以指导排卵[31]。PTGS1编码的蛋白是前列腺素H2转化为前列腺素D2的关键酶[32]，这种酶广泛分布于子宫、卵巢、输卵管等部位，参与生殖系统的调控[33]。NR3C2产物盐皮质激素受体主要参与紧张焦虑情绪调控，最新研究提示盐皮质激素可能在牛卵巢中发挥内分泌、旁分泌、自分泌的作用[34]。

KEGG 通路富集分析结果表明，AGE-RAGE信号通路、TNF 信号通路、IL-17信号通路等是白芍治疗POI 的重要信号通路。梁嘉丽[35]研究发现，颗粒细胞自噬参与了POI的发病过程。包继明[36]发现，AGE-RAGE 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路，而PI3K/Akt 信号通路是参与颗粒细胞自噬的信号通路[37]。李宁[38]研究白藜芦醇对POI大鼠的治疗效果也发现，通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路可以抑制颗粒细胞凋亡来达到治疗POI的目的。TNF信号通路是炎性反应的重要通路，TNF-α 是重要的炎性因子，能诱导中性粒细胞的浸润，引起炎症反应。近年来的研究表明，炎症性衰老在POI的发病机理中起着重要作用[39]。俞晓敏等[40]研究发现，罗格列酮可减轻腹腔注射脂多糖诱导大鼠慢性低度炎症反应以改善卵巢功能。此外，TNF-α 蛋白表达增加能明显促进卵巢生殖干细胞的增殖[41]，而卵巢干细胞巢的衰老和退化被认为是导致卵巢生殖功能衰退的主要因素[42-43]。IL-17F 是IL-17 家族的一种原型细胞因子，它可以诱导不同的组织和细胞产生炎性细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶。研究表明，IL-17F 参与溃疡性结肠炎的免疫调节[44]，IL-17在固有免疫水平和适应性免疫水平均具有重要的抗感染作用[45]。

综上所述，白芍可能通过有效成分山柰酚、β-谷甾醇、儿茶素介导AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路等发挥抗炎性反应、调节免疫、增加卵母细胞数量及抑制颗粒细胞凋亡等药理作用来治疗POI。本研究针对白芍单味中药仅展开预测研究存在一定局限性，后续将进一步体内体外验证白芍治疗POI多成分、多靶点的机制特点。