鱼藤酮致帕金森病模型的最佳造模方法探讨

毛美玲，关银瑞，闫咏梅，李 涛，王 豆

帕金森病(PD)是一种常见的老年神经系统退行性疾病，一个准确、稳定可被复制的模型对研究帕金森病的病因病机及治疗药物的研发等有重要的意义。目前采用鱼藤酮(rotenone)创建帕金森病动物模型尚无统一标准，因此造模成功率差异较大。本研究旨在探寻尽可能全面模拟出帕金森病特征且死亡率较低的最佳鱼藤酮造模方案，以供参考。

1 鱼藤酮的发现及其理化特性

鱼藤酮分子式为C23H22O6，属异黄酮家族的一员，最开始是从醉鱼豆属植物毛鱼藤(serris)根茎和叶的胶状液汁鱼藤胶中提取分离出的无色化学物质，为鱼藤根的主要活性成分，特别存在于鱼藤属、灰叶属等植物中，同时也存在于一些中草药如地瓜子、苦檀子、昆明鸡血藤根中。由于其具有杀虫谱广、不易产生耐药性、毒性较小、残留效应时间短和大量存在于自然界等优点，一直以来作为一种安全有效的天然植物性杀虫剂而被广泛应用于农作物、果树和药材等的虫害防治和鱼塘清理[1]。鱼藤酮几乎不溶于水，但易溶于许多有机溶剂，如氯仿、乙醚和丙酮等。因其暴露在光和空气时容易氧化分解，所以为保持活性稳定常在干燥、低温、避光和密封条件下储存[2]。

2 鱼藤酮的毒性作用机制

鱼藤酮常易通过消化道和皮肤被机体吸收，其高强脂溶性使其容易穿透所有生物膜包括血脑屏障，且不需要借助多巴胺转运体便可直接进入机体的细胞质中[3]。鱼藤酮作为一种线粒体复合体Ⅰ抑制剂，其发挥生物学效应是通过抑制细胞呼吸链还原型辅酶Ⅰ(NADH)脱氢酶的活性，损害氧化磷酸化的过程，导致三磷酸腺苷(ATP)生成减少，从而影响呼吸链对氧的利用，造成抑制性缺氧而发挥细胞毒作用[4]。研究显示，经鱼藤酮干预后，参与线粒体功能、内质网功能和自噬的蛋白质有所改变，蛋白质分子分析显示，30种蛋白质过表达及114种蛋白质表达下调，即触发了氧化应激并诱导细胞凋亡，有效模拟了帕金森病的细胞畸变[5]。

3 鱼藤酮与帕金森病的联系

帕金森病是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，临床以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征，主要的病理改变为中脑黑质(substantianigra，SN)致密区多巴胺(dopamine，DA)能神经元退行性变性死亡、残存的神经元内形成Lewy小体(lewybodies，LBs)及纹状体多巴胺含量明显减少，从而导致帕金森病的核心运动特征，也是目前对症治疗的目标。帕金森病的病因尚未明确，但受到遗传、环境等因素影响，业已证实环境中的有害物质是帕金森病的重要致病因素之一[6]。种种因素导致细胞功能障碍或产生兴奋性神经毒性作用、年龄老化的协同促进作用而致病。帕金森病病人和鱼藤酮长期的慢性暴露均有多巴胺能轴突丢失及最终会致细胞死亡的共同表现[7]。即使鱼藤酮一直被视为安全杀虫剂，但在长期、大量使用及慢性接触后不仅会污染环境，而且对机体的神经系统功能有一定影响[8]。复合体Ⅰ在全脑普遍抑制，但仅黑质多巴胺神经元变性，提示黑质多巴胺能神经元对鱼藤酮的易损伤性[9]。鱼藤酮对中枢神经系统的毒性作用提示二者之间存在病原学关系。已有研究表明，90%以上的帕金森病病人的致病因素都与环境污染物密切相关，其中杀虫剂鱼藤酮接触尤为明显[10]。为了解两者之间的潜在联系，许多研究人员利用鱼藤酮成功诱导出各种不同的帕金森病动物模型和细胞模型，该模型复制了大部分相似的运动症状和组织病理特点。鱼藤酮选择性地进入脑内后，多巴胺神经元对其高度敏感，导致黑质、纹状体多巴胺神经元线粒体功能障碍，诱发变性继而引起多巴胺能神经元死亡[11]，除此之外还伴随有Lewy小体样包涵体形成，相比于其他模型，这是鱼藤酮制备帕金森病模型所独有的。

4 鱼藤酮建立帕金森病动物模型

由于鱼藤酮可复制帕金森病的部分运动缺陷及病理特征[12-13]，因此，被广泛用于建立啮齿动物的帕金森病模型[14]。鱼藤酮诱导帕金森病动物模型分为急性、亚急性或亚慢性、慢性动物模型。模型在病原学、病机、病理生化及行为学等多方面的精确程度对研究帕金森病的致病因素、潜在机制、神经保护和恢复治疗以及疾病预防等均有宝贵价值。鱼藤酮慢性模型不仅造模成功率高，而且在多方面均表现出与帕金森病相关的特征，且其慢性、进行性病程也与帕金森病的发病过程类似，实验成本相对较小，故实验多选择慢性损耗模型来研究帕金森病的特征[15]。

4.1 皮下注射 目前，采用鱼藤酮诱导帕金森病动物模型尚无统一标准，造模成功率也因实验材料、造模方法等的不同而差异较大。经过查阅大量文献后，将造模成功的影响因素概括为动物因素和给药因素两大方面。动物因素包括种属、品系、月龄、性别、体质量等；给药因素包括溶剂、给药方式、接触剂量、持续时间和间隔时间等，不同选择对血药浓度的影响也不同。本研究将按给药方式探讨鱼藤酮造模的最佳方法。采用不同标准皮下注射鱼藤酮建立帕金森病模型的情况详见表1。

从表1可看出，多数研究选择雄性大鼠，较少有选择雌性大鼠者，究其原因可能与雌性大鼠体内的雌激素对实验结果的准确性会造成一定影响有关。SD大鼠比Wistar大鼠更多用于建立帕金森病动物模型；哺乳动物对鱼藤酮的敏感性差异较大[26]。因此，给药剂量的确定也受鼠体质量大小的影响。实验大鼠体质量的大小在(200±20)g，尽管体质量稍大(如250～300 g)的大鼠也有成功造模的研究，但在实验时，大鼠开始需适应性喂养1周，之后至少3周的饲养则可能会使体重过大进而影响行为学评估的结果，且大鼠比小鼠更能耐受刺激，可以降低死亡率，提高生存率，使数据更加丰富。

表1 不同方案皮下注射鱼藤酮建立帕金森病模型

关于给药剂量各实验研究有所不同，且差异波动较大，每天1～5 mg/kg。赛燕等[27]给予雄性SD大鼠注射鱼藤酮(1.0 mg/kg和1.5 mg/kg)，持续28 d后引起帕金森病病理样改变，且这种改变在更高的剂量组更明显，表明相比于1.0 mg/kg剂量，1.5 mg/kg更佳。为确定皮下注射鱼藤酮建立帕金森病模型的最佳剂量，Zhang等[28]将鱼藤酮按照1.5 mg/kg、2.0 mg/kg或2.5 mg/kg的不同剂量注射给雄性Wistar大鼠，持续5周。结果证实，每天皮下注射2 mg/kg鱼藤酮不仅复制了帕金森病的典型特征和组织病理学特征，且促进了α-syn的形成，并导致黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和纹状体多巴胺阳性神经元明显减少，同时保持了低死亡率。给药持续时间各自也有所不同，基本浮动在5～60 d，最常处理的持续时间为20 d左右。通常在注射给药7 d大鼠便可出现行为学及病理方面的改变，当持续2～3周时各方面的变化最明显[29]。综合多篇文献实验结果发现，鱼藤酮给药剂量过大时，容易导致急性中毒，增加死亡率；而剂量过少则不易出现帕金森病样典型症状，因此建议使用2 mg/kg作为给药剂量应当最佳。由于持续时间的差异也使造模成功率有了高低之分，持续时间过短则难以解释环境毒素因素使人患帕金森病的慢性过程，且病理和行为学改变未达到峰值；而当持续时间过长，尤其是继续用药3周后大鼠会很快因进食困难死亡，故为使各方面改变最为明显且降低死亡率，建议持续时间为3周。

4.2 其他常用给药方式

4.2.1 腹腔注射 闫雪等[30]连续21 d通过腹腔按照每天1 mL/kg(溶液配比为3 mg/mL)给雄性Wistar大鼠注射鱼藤酮；Bassani等[31]采用此方式连续28 d给予体质量260～240 g大鼠鱼藤酮每天2.5 mg/kg，造模结束后通过行为学测试发现大鼠的运动迟缓、频率明显减少，纹状体中多巴胺含量也明显比对照组低，且黑质TH神经元呈现出中度丢失的状态；Jagota等[32]持续48 d给予大鼠腹腔注射鱼藤酮2.5 mg/(mL·kg)，结果观察到模型大鼠的昼夜节律紊乱且无法恢复，而此种变化在衰老和帕金森病中均有表现；Cheng等[33]给予大鼠腹腔注射鱼藤酮每天3 mg/kg(每天1次，连续3周)，最终显示鱼藤酮导致黑质致密部的运动功能缺损和神经元丢失，均成功制备出帕金森病动物模型。造模成功率的极大提高可能是因为剂量中等、时间长度中等，操作性强。

4.2.2 黑质立体定向注射 常宇涛等[34]将115只2～3月龄SD大鼠(体质量250～300 g)分成模型1～4组，鱼藤酮0.5 μg、2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg溶于2 μL二甲基亚砜中，通过黑质立体定向注射的方法注入大鼠体内，结果显示，2.5～5.0 μg的鱼藤酮可使大鼠行为学记分在2分以上，即诱导出较可靠的黑质多巴胺能神经元损伤的动物模型。Bai等[35]将鱼藤酮(8 μg鱼藤酮溶于2μL二甲基亚砜中)，采用立体定向法以1 μL/min的速率注射入大鼠脑中，最终抑制了模型大鼠的细胞生长且促进了细胞凋亡。高胆固醇血症已成为神经退行性疾病的预后危险因素，甚至导致帕金森病的发病，Fagotti等[36]以0.33 μL/min的速率向体质量为280～330 g雄性Wistar大鼠脑内每个半球注入1 μL鱼藤酮，每次持续3 min，21 d后模型大鼠不但有运动障碍，同时血浆脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白水平升高，表明鱼藤酮也参与了外周早期生物标志物血脂对帕金森病的影响。鱼藤酮剂量大小也可引起大鼠明显的行为学和病理改变差异，低剂量和较高剂量分别使大鼠的表现更接近于帕金森病早期、晚期的特征。

4.2.3 接触给药 万叶等[37]连续4周以0.1 mg/d的较低剂量使用接触式给药方式成功诱导小鼠行为和病理发生类帕金森病样表现。这种给药方式未直接注射入大鼠体内，因此，避免了直接给药给小鼠造成的外周毒性，可明显提高造模成功率。

4.2.4 鱼藤酮微球诱导大鼠帕金森病模型的建立 王英舟等[38]将鱼藤酮按照每天2.5 mg/kg的剂量通过颈部皮下注射法向体质量为200～250 g的每日注射组雄性SD大鼠给药；于第1天、第8天、第15天、第22天给微球组鱼藤酮微球混悬液(采用乳化-溶剂挥发法制备)，实验周期为28 d。两组大鼠均出现接近帕金森病的典型形态的特征，如呈弓背状、动作迟缓、走路步态不稳，行为学记分为3分以上，证明造模成功。相比于每日注射组，28 d的给药周期微球组仅有4 d需给药，明显减低了给药频率，人为干预的减少也降低了大鼠死亡率。

4.2.5 鼻内给药 帕金森病病人常以嗅觉障碍为首发症状。Sasajima等[39]发现长期经鼻给予鱼藤酮能降低小鼠的嗅觉功能且使黑质多巴胺神经元的轴突变性，提示鱼藤酮通过鼻腔途径使大脑多巴胺神经元变性。

4.2.6 灌胃给药 Liu等[40]连续6周给予3月龄雄性小鼠灌服鱼藤酮(10 mg/kg)；黄玉菊等[41-42]分别给予10周龄、8周龄雄性C57BL/6n小鼠[体重(23±2)g]每天30 mg/kg(每天1次，连续6 d，共9周)、每天5 mg/kg(每天1次，连续6 d，共12周)鱼藤酮灌胃，测试结果均显示模型小鼠的转头时间、爬杆时间均延长，在棒时间缩短，多巴胺、多巴胺代谢产物高香草酸(HVA)及二羟苯乙酸(DOPAC)含量均明显降低，符合帕金森病的行为学和病理学改变。

每一种给药途径都在不同程度上再现了帕金森病的主要特征，并具有一定的优缺点。腹腔注射和灌胃给药可行性强，造模成功率也较稳定；黑质立体定向注射的操作复杂，且需熟练的技术，造模的成功与否对操作手法有一定的要求并造模成功率的大小也与之密切相关，因此，在实际应用中难以被推荐使用；鼻腔给药造模方式的复制也较少，且不够成熟；微球给药作为一种替代性的皮下给药载体，允许药物在数周到数月的时间被控制释放，因其给药频率的缩短也明显减少了研究人员的工作量，但这种优势也同时被质疑是缺点，因其与人帕金森病慢性致病的病因有所相悖，且其重现性仍需其他实验室的确认。接触给药是一种不同于其他给药方式的做法，其使动物间接吸收鱼藤酮的方式不但与人长期通过皮肤、误吸鱼藤酮的病因相似，且不使大鼠产生外周毒性，降低了死亡率，也是值得反复验证造模成功率并加以推广的造模方法。

5 小 结

帕金森病是继阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)之后第二常见的神经退行性疾病[43]，已成为中老年人“第三杀手”。为尽快找出帕金森病的致病原因，研究发病机制和病程变化，以及研发出有效的治疗药物，一个准确、稳定可被复制的理想模型则必不可少。一个精确的帕金森病实验模型应该重现该病中的缓慢致病进程、典型运动症状的改变、进行性和选择性黑质纹状体多巴胺能变性等从病因病机至行为病理的不同层面。目前，鱼藤酮模型因各种优势被普遍应用，但也存在一些局限和问题：①鱼藤酮的注射剂量和持续时间并没有一个确定的标准，推荐大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮每天2 mg/kg，持续3周的给药方案；②虽然这种类似的给药方式造模成功率高，但实验中所用样本量较少，且存在易感和不敏感个体，削弱了结果的可信度；③在日常生活中不会发生毒素给药的腹腔注射或皮下注射途径，这些给药途径绕过了机体的生理和代谢防御。除了最常用的皮下注射方式，接触给药的优点也相当值得关注，因此，在之后的研究中，希望能够着重解决关于鱼藤酮皮下注射造模的现存问题，同时验证接触给药的可行性和重现性。