细胞自噬在冠状病毒感染中作用机制的研究进展

夏璐，王栋涵，徐盟龙，党玉丽，魏战勇

(1.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450046； 2.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002)

细胞自噬(autophagy)是将细胞内受损的细胞器或长寿蛋白降解成小肽或氨基酸后供机体再次利用的过程。1963年，比利时生物学家克里斯汀·德迪夫在溶酶体国际会议(CIBA Foundation Symposium on Lysosomes)上首次提出“自噬”的概念。20世纪90年代，日本生物学家大隅良典发现自噬的作用机制。基于在细胞自噬研究方面的突出贡献，上述2位科学家分别于1965年和2016年获得诺贝尔生理学或医学奖[1]。病毒感染细胞后，自噬会通过调节细胞的免疫状态来维持细胞内稳态。然而，细胞自噬在病毒感染中扮演的角色比较复杂。细胞自噬可以通过清除丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等抑制病毒感染。同时，一些病毒则通过逃避宿主的自噬和免疫监视、促进自身复制，如萨柯奇病毒B3型、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)和登革热病毒(dengue virus,DENV)等[2]。目前，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)肆虐全球，研发有效的疫苗和抗病毒药物刻不容缓。与其他RNA病毒类似，冠状病毒利用宿主细胞的自噬途径促进自身复制，但是否所有的冠状病毒都利用细胞自噬促进自身的复制和致病尚不清楚。因此，本文阐述了冠状病毒、细胞自噬以及细胞自噬在冠状病毒感染中的作用机制，重点分析了细胞自噬和冠状病毒感染的关系，为冠状病毒的预防和治疗提供新思路。

1 冠状病毒的概述

21世纪以来，冠状病毒在全世界快速传播，严重危害人类健康，给社会造成极大恐慌。截至目前，全球已累计确诊新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)病例超4亿人次，累计死亡人数超600万，造成的直接经济损失高达数十万亿美元。冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，在自然界中广泛存在，可感染人、猪、牛、猫和鸡等多种脊椎动物。根据系统发育进化树，冠状病毒可以分为α、β、γ和δ这4个属[3]。α属冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪肠道甲型冠状病毒(swine enteric alphacoronavirus,SeACoV)等，这些病毒主要感染仔猪肠道引起腹泻症状[4]。β属冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和SARS-CoV-2，主要感染人的呼吸道[5]。γ属冠状病毒包括鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)，可引起鸡的呼吸道、泌尿生殖道症状[6]。δ属冠状病毒包括猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)，感染仔猪后和TGEV/PEDV引起相似的临床症状和病理变化，临床上难以区分[7]。

冠状病毒为有囊膜不分节段的单股正链RNA病毒，基因组全长约27～32 kb，是目前已知最大的RNA病毒。冠状病毒基因组排列顺序为：5′非编码区(untranslated region,UTR)，含有1个甲基化帽子—开放阅读框(open reading frame,ORF)1a/1b—纤突蛋白(spike protein,S)—包膜蛋白(envelope protein,E)—膜蛋白(membrane protein,M)—核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)—3′非编码区(UTR)，含有1个PolyA尾巴[8]。冠状病毒主要编码4种结构蛋白：S蛋白介导病毒的入侵和膜融合，含有主要的抗原表位；E蛋白与包膜结合；M蛋白参与子代病毒粒子的外包膜形成及出芽释放；N蛋白参与病毒RNA的组装。ORF1a/1b主要编码病毒的非结构蛋白(non-structure protein,nsp)，这些蛋白不参与构成病毒本身结构，但是调控病毒的转录和复制[9]。由于冠状病毒的S蛋白容易发生氨基酸的插入、缺失或突变导致病毒的变异，冠状病毒疫苗不能起到很好的保护作用，且市场上尚无完全抑制冠状病毒及其变异株传播的特效药，因此了解冠状病毒致病机制，为研发抗病毒药物和疫苗提供新思路是目前研究的热点[10]。

2 细胞自噬的研究现状

细胞自噬即“吃掉自己”，是真核生物中高度保守的生物进化过程，在维持细胞稳态、促进新陈代谢等方面起着举足轻重的作用[11]。细胞内多余或受损的细胞质、细胞器被双层膜囊泡(double membrane-bound vesicle,DMV)包裹后形成自噬体(autophagosome)，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞的自我更新[12]。细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生(如神经退行性疾病和癌症等)。饥饿、高温和缺氧等应激条件也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。因此，了解自噬发生、形成及调控的分子基础具有重要意义。

真核细胞介导自噬的方式有巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。这3种方式都是通过溶酶体和自噬体的融合降解细胞质蛋白，主要区别是底物和自噬泡的封闭方式不同[11]。巨自噬是通过DMVs将细胞质成分运送至溶酶体，DMVs与溶酶体融合形成自噬体。微自噬是指溶酶体膜直接内陷，包裹细胞质中的待降解成分。CMA是靶蛋白上特定的序列被分子伴侣识别形成复合物，如热休克同源蛋白70/73识别底物的特定氨基酸序列，形成复合物与溶酶体膜上的受体-溶酶体相关膜蛋白2A(Lamp-2A)结合，导致底物的去折叠化和降解。其中，巨自噬是最常见、最保守以及研究最多的自噬类型[13]。

2.1 细胞自噬的分子作用机制

细胞自噬在真核生物中的重要性得到越来越多关注。近年来，自噬分子水平的调节在酵母细胞中取得突破性进展。目前，从酵母系统中已筛选鉴定出40多个自噬相关基因(autophagy-related genes,Atg)，这些基因在霉菌、植物、寄生虫和哺乳动物中高度保守，表明自噬在整个物种应对饥饿的进化过程中发挥重要作用[14]。自噬开始由磷脂双分子层形成1个独立的囊泡，这个囊泡来源于内质网(endoplasmic reticulum,ER)、高尔基体(Golgi)或内体。接着，囊泡开始吞没细胞质成分，如蛋白质聚集体、细胞器和核糖体，包裹这些内容物形成DMVs。DMVs与溶酶体融合，通过溶酶体酸性蛋白酶促进自噬体内容物的降解。此时，溶酶体通透性增加，一些氨基酸转运载体把降解产物重新运送至细胞质用于大分子的重建或代谢[15]。因此，自噬促进细胞能量再利用，去除受损的、失去功能的蛋白或细胞器，是细胞的能量/物质再循环工厂。

细胞自噬的生物过程在分子水平上实现需要5个步骤：(1)双层膜囊泡的形成；(2)Atg5-Atg12-Atg16L形成复合物并与双层膜囊泡融合；(3)微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)的转化并插入延伸囊泡膜，形成自噬体；(4)自噬体捕获需要降解的物质；(5)自噬体和溶酶体结合形成自噬溶酶体，蛋白水解酶降解内容物[2,16-17]。

在酵母中，双层膜囊泡膜最初在细胞质中被称为自噬体前体结构(pre-autophagosomal structure,PAS)的地方形成。哺乳动物细胞质中不存在PAS，DMVs可能来自于ER、Golgi甚至核膜[18]。Atg1(Ulk-1)复合物是诱导自噬体的初始复合物，包括Atg1、Atg13和Atg17，受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mammalian target of rapamycin,mTOR)的调节。TOR激酶通过感知能量变化调节Atg13的磷酸化：当能量充足时，Atg13磷酸化，不能与Atg1相互作用；当能量缺乏时，Atg13与Atg1、Atg17形成复合物参与自噬体的形成[19]。Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)复合物，包括Vps34-Vps15-BECN1-Atg14，参与自噬体的成核。Vps34仅以磷脂酰肌醇作为底物就可生成磷脂酰肌醇三磷酸，这有利于招募其他的Atg蛋白和自噬体的延伸[20]。

自噬体的延伸需要2个泛素样结合系统，即Atg5-Atg12的共轭结合以及LC3的转化。Atg12首先被Atg7(类似泛素活化酶E1)激活，再通过Atg10(类似泛素活化酶E2)与Atg5共轭结合形成复合物，与二聚体Atg16L形成Atg5-Atg12-Atg16L形成多聚体复合物，参与自噬体的延伸[21]。LC3B属于胞质蛋白，发生自噬后被半胱氨酸蛋白酶Atg4蛋白水解切割成LC3B-Ⅰ，然后在Atg7和Atg3(类似泛素活化酶E2)作用下与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)结合形成LC3B-Ⅱ[22-23]。LC3B-Ⅱ参与膜的半融合和底物的降解，其在自噬体膜上的聚集和结合依赖Atg5-Atg12，可以作为检测自噬的标记物。

自噬体自身的DMVs膜融合完成后，与溶酶体融合，这是自噬体的成熟阶段。微管抑制剂抑制自噬体与溶酶体的融合，提示细胞骨架在自噬体成熟过程中发挥作用[24]。溶酶体蛋白Lamp-1和Lamp-2等对自噬体的功能也至关重要。溶酶体组织蛋白酶B/D/L进入自噬体，降解底物产生氨基酸或蛋白，为细胞提供营养、能量、或再循环产生新的大分子[25]。

2.2 细胞自噬与病毒感染的关系

研究发现，自噬不仅在维持细胞稳态方面发挥重要作用，与病毒感染也存在密切联系。病毒感染细胞的生命周期可引起细胞发生自噬。CD46是麻疹病毒(measles virus,MV)粘附和入侵细胞的主要受体。MV感染细胞初期，CD46激活Golgi相关的coiled-coil结构域招募的VSP34-BECN1复合物，进而激活免疫相关的GTP酶基因家族M蛋白依赖的信号通路诱发自噬[26]。HIV入侵细胞后，病毒囊膜与细胞膜融合的过程中促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，诱导细胞自噬的发生[27]。基孔肯亚病毒复制时引起的ER应激(ER stress,ERS)和ROS的产生，促进细胞自噬的发生[28]。构成病毒的组分也可引起细胞发生自噬。病毒感染细胞后，宿主细胞感知病毒的基因组和蛋白质，直接与自噬调节蛋白相互作用，或诱导细胞应激间接调节自噬。自噬在病毒感染过程中有正反2个效果。一方面，自噬通过降解病毒粒子或启动机体的免疫防御系统抵御病毒的感染；另一方面，自噬被病毒“劫持”促进病毒的复制[2]。病毒为了生存，已进化形成多种策略来对抗或利用宿主自噬。

2.2.1 细胞自噬的抗病毒作用 由于自噬的典型功能是形成自噬体，将底物运送至溶酶体进行降解，因此自噬发挥抗病毒作用主要是通过以下5个方面：(1)降解病毒组分(又称为“病毒自噬”)；(2)将病毒核酸运送至内源的模式识别受体，激活宿主的先天免疫反应；(3)将病毒抗原呈递给主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ和MHC Ⅱ分子，激活宿主的适应性免疫应答；(4)通过调节线粒体的氧化应激来诱导先天免疫应答：(5)提高细胞的存活率[15,29]。脊髓灰质炎病毒感染细胞形成的自噬体降解病毒RNA，半乳糖凝集素8识别暴露的β-半乳糖苷，降解和消化包裹的病毒核酸[30]。P62结合辛德毕斯病毒(sindbis virus,SINV)的核衣壳蛋白将其转运到自噬体中进行降解，自噬体或自噬溶酶体的超微结构中观察到SINV的存在直接证明了这一现象[2]。敲除Atg5基因后，水泡性口炎病毒或仙台病毒感染细胞后抑制了依赖于TLR7的IFN产生途径[31]。

2.2.2 细胞自噬促进病毒感染 自噬不仅只有抗病毒作用，一些病毒利用很多策略逃避宿主的自噬，甚至利用自噬来促进自身的增殖[2,15,29]。RNA病毒的组装和复制需要在细胞内膜上进行，自噬体的双层膜结构聚集了大量的复制转录复合物(replication-transcription complexes,RTCs)，为病毒的复制提供场所，防止RTCs触发免疫反应，为基因组的合成提供脂类。激光共聚焦显微镜发现，DENV、FMDV等病毒RTCs与LC3在自噬体膜上发生共定位，提示自噬体为病毒的复制提供场所[32-33]。病毒还通过自噬调节细胞的能量代谢促进病毒的复制。DENV感染后，自噬体将脂滴运送至溶酶体耗尽生成游离脂肪酸，游离脂肪酸在线粒体经过β氧化生成腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，为DENV的复制提供能量[34]。此外，自噬还通过抑制宿主的先天免疫反应、降解细胞的抗病毒蛋白促进病毒的复制[2]。

3 细胞自噬在冠状病毒感染中的作用机制

自噬与病毒之间的关系是特异性的，因此了解自噬与病毒之间的相互作用关系对研究病毒的致病机制有重要作用[29]。冠状病毒是RNA病毒家族的重要成员，对人、猪、牛、马、家禽、狗和猫等多种动物具有感染性。21世纪以来，人类已经遇到SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2共3次冠状病毒的袭击，其广泛的流行和较强的致病性给全球经济造成了巨大的损失，也给人类健康带来了严重威胁[12]。目前，自噬抑制剂氯喹在体外可以抑制SARS-CoV-2增殖，临床中已应用于COVID-19的治疗[35]。目前，关于冠状病毒与细胞自噬的研究主要集中在细胞自噬与冠状病毒感染的关系及其分子作用机制。

3.1 冠状病毒诱导细胞发生自噬

冠状病毒感染宿主细胞后，细胞的膜结构发生重排，产生病毒复制细胞器。DMVs是所有冠状病毒感染细胞后形成的。除此之外，α和β冠状病毒产生卷曲膜，γ和δ冠状病毒产生带有双膜球体的拉链ER[36]。通过透射电子显微镜观察PEDV和PDCoV感染后的细胞，发现了DMVs、卷曲膜和拉链ER的存在[36-37]。这些细胞器是病毒RNA合成的场所，为病毒RTCs的高效组装提供了平台。同时，DMVs也为病毒RNA以及参与转录复制的病毒nsp提供保护屏障，使其不受宿主免疫系统攻击，极大提高了病毒的复制效率[38]。SARS-CoV、MERS-CoV和IBV感染细胞后的RNA合成发生在DMVs内部[39]。在透射电子显微镜下观察到的DMVs形态结构与细胞自噬体极度相似，以此推测DMVs与自噬体的形成有一定关系，即DMVs可能是病毒感染形成自噬体的开始[40]。冠状病毒感染细胞后，参与病毒复制的蛋白(如nsp2、nsp3和nsp8等)与内源性LC3发生共定位，提示细胞自噬参与调节病毒的复制[41-42]。冠状病毒感染可以激活自噬并监测到完整的自噬流。TGEV和PDCoV感染细胞后经western blot检测发现，LC3-Ⅱ的表达逐渐增加，p62的表达逐渐减少[43]。然而，ZHAO等[44]研究发现，在敲除Atg5基因的小鼠骨髓源巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中，MHV的复制和释放并未受到影响。同样，野生型和敲除Atg5基因的过表达人血管紧张素转换酶2受体的小鼠成纤维细胞感染SARS-CoV后，病毒的滴度也没有发生变化，说明细胞自噬及Atg5基因并未参与SARS-CoV的复制[45]。进一步研究发现，MHV感染细胞后非脂化LC3包裹的DMVs对病毒复制是必要的，但与细胞自噬无关[46]。因此，每种冠状病毒具有独特的复制需求，细胞自噬是否参与冠状病毒的复制受冠状病毒毒株、种属、感染组织或细胞的差异影响。

3.2 细胞自噬影响冠状病毒的感染

研究表明，细胞的自噬机制被冠状病毒劫持以利于冠状病毒的复制。ZHU等[43]证明TGEV感染猪小肠上皮细胞后线粒体氧化应激诱导线粒体发生自噬，抑制细胞的凋亡途径，从而促进了TGEV的复制。GUO等[47]发现细胞自噬促进PEDV的复制，用BECN1或Atg5缺失或3-MA处理的Vero细胞感染PEDV，病毒的拷贝数或滴度明显降低；自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理后病毒的滴度显著增加。深入研究发现，冠状病毒的相关组分如nsp3、nsp4、nsp6、N、木瓜样蛋白酶(papain-like protease 2,PLP2)、ORF3、ORF8b和ORF9b等可以激活细胞自噬[48]。细胞共转染表达SARS-CoV和MERS-CoV的nsp3和nsp4重组质粒，诱导DMVs的形成。IBV、MHV、SARS-CoV、MERS-CoV和PEDV的nsp6可诱导自噬体的形成并抑制自噬体的扩张[12,49]。SARS-CoV、MERS-CoV和PEDV的PLP2-TM通过与BECN1相互作用引起细胞发生自噬，促进BECN1与STING的结合，以此调节宿主细胞的抗病毒策略和冠状病毒的复制[50]。PEDV和SARS-CoV-2的ORF3也可引起细胞发生自噬[51-52]。除此之外，TGEV和MHV的N蛋白也证明诱导细胞发生自噬，并与LC3共定位于DMVs[43,53]。

然而一些研究用调控自噬的药物或干扰自噬相关基因会得到相反的结果。GUO等[54]发现TGEV(H165株)诱导ST细胞发生自噬，渥曼青霉素及干扰内源性的LC3、Atg5和Atg7处理后的细胞促进了TGEV的复制。KO等[55]研究表明，自噬抑制PEDV在IPEC-J2细胞中的复制，且RAPA可以缓解PEDV感染造成的细胞死亡。尽管细胞自噬调控冠状病毒复制的结论受到一些质疑，造成上述结果的差异同样可能是使用了不同的细胞系、不同的毒株，但这也说明细胞自噬可能不是参与冠状病毒复制的主要因素。因此，自噬如何影响冠状病毒的复制有待进一步研究。

3.3 冠状病毒调控细胞自噬的分子作用机制

冠状病毒介导的细胞自噬受到多种分子机制的调节。BECN1是自噬泡形成的关键蛋白，参与早期自噬体的形成、促进自噬体与溶酶体的融合降解内容物。冠状病毒通过多种策略调节BECN1的活性干预细胞自噬。人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)NL63 nsp3的PLP-TM结构域结合到BECN1上，抑制自噬体与溶酶体的融合，从而促进病毒的复制[50]。MERS-CoV间接调节BECN1的蛋白水平表达。MERS-CoV感染VeroB4细胞后Akt1发生磷酸化，激活E3泛素连接酶(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)，BECN1发生泛素化进而降解，从而抑制了自噬体与溶酶体的融合[56]。HCoV-NL63 nsp3的PLP-TM结合到BECN1/STING1上调节先天免疫反应，通过抑制IFN的产生来调节病毒的复制[50]。其他冠状病毒(如PEDV和SARS-CoV)的PLP-TM也可以与BECN1相互作用拮抗IFN的产生[57]。

冠状病毒利用宿主细胞的运输机制包裹ER形成DMV，细胞内参与膜重排最多的细胞器是ER，因此一些冠状病毒的跨膜糖蛋白嵌入ER到引起ERS也不足为奇[58]。为了恢复ER的稳态，非折叠蛋白反应(unfolded proteins response,UPR)增加即诱导细胞发生自噬[59]。UPR信号通路主要由位于ER膜上的3种应激感受蛋白所介导：肌醇依赖酶1(inositol requiring kinase 1,IRE1)、转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)和PKR样ER调节激酶(protein kinase R like ER kinase,PERK)。冠状病毒感染引起UPR的3个信号通路都参与诱导细胞自噬的发生。IBV诱导细胞自噬依赖IRE1介导的ERK1/2信号通路，而不依赖ATF6和PERK通路[60]。PEDV的ORF3蛋白通过PERK-eIF2α信号通路诱导ERS引起细胞发生自噬[51]。mTOR在负调节病毒感染引起的自噬过程中发挥重要作用。SARS-CoV-2的S蛋白和PEDV的nsp6则通过经典的PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞发生自噬[61-62]。

3.4 细胞自噬与SARS-CoV-2治疗相关药物

SARS-CoV-2肆虐当下，国际疫情形势严峻复杂。SARS-CoV-2感染引起人类多细胞、多组织以及多器官的急性损伤，但是目前仍没有能够完全抑制SARS-CoV-2传播的有效药物。美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)批准了一些药物用于COVID-19的治疗，其中近一半的药物是参与调节细胞自噬的抑制剂(表1)[63-64]。目前，并没有证据表明这些药物直接作用于SARS-CoV-2，推测这些药物可能作用于细胞，通过自噬体的累积诱导细胞凋亡、破坏病毒的复制周期。氯喹或羟基氯喹已参与临床治疗SARS-CoV-2的联合用药。尽管如此，服用这些药物带来的毒副作用仍不能被忽视，因此需要根据临床情况合理用药。

表1 FDA批准治疗COVID-19的自噬相关药物

4 展望

冠状病毒具有跨种传播的能力，对人类和动物构成巨大的潜在威胁。其中，COVID-19对全球经济生活造成一系列重大影响[65]。目前，全球科学家正在加紧研究SARS-CoV-2的来源和致病机制，以期为SARS-CoV-2的有效防控提供理论依据。细胞自噬通过降解途径维持内环境稳定，抵御病原微生物的感染。现有研究表明，自噬可能是治疗冠状病毒的潜在靶点。每种冠状病毒都可能以独特的方式引起细胞发生自噬，那么了解自噬与细胞内不同途径相互作用影响冠状病毒复制的机制，以及探讨将这些作用应用在其他冠状病毒感染中的可行性，是成功应对类似SARS-CoV-2和未来新型冠状病毒的重要因素。展望未来，在充分理解冠状病毒感染的细胞生物学方面，研究者可以从冠状病毒诱导细胞自噬研究中获得启示。虽然目前细胞自噬对冠状病毒复制的必要性有待进一步确认，但是，自噬作为了解冠状病毒与宿主相互作用的重要途径，对其研究有助于深入了解冠状病毒感染引起疾病的病理特征、寻找控制冠状病毒复制的关键因素以及探索调节炎症反应的靶点等。此外，通过靶向宿主细胞途径而非靶向病原体来增强宿主细胞的抗病毒能力，是应对包括COVID-19在内的突发及重大流行病更重要、更紧迫以及更有前途的治疗措施。