不同发育阶段‘文紫椒1号’果色色素的比例和组织定位

屈用函，袁恩平，张雪廷，王绍祥，王 灿，赵水灵，李 罡，顾 凡，张洪玲，赵昶灵，李桂琼，陈杞临

（1文山壮族苗族自治州农业科学院生态环境资源研究所，云南文山 663000；2文山壮族苗族自治州农业科学院蔬菜研究所，云南文山 663000；3云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201）

0 引言

目前，云南省文山州主栽的辣椒(Capsicum annuum)品种是有370余年种植史的丘北辣椒系列；辣椒已成为文山州继三七(Panax notoginseng)后的第二大生物产业[1]。‘文紫椒1号’是文山州大面积种植的、叶、花和果均具观赏性的丘北辣椒紫色品种的典型代表[2]。‘文紫椒1号’叶片近轴面为紫绿，远轴面的叶脉、叶柄及花瓣顶端的2/3和边缘为紫色，茎淡紫，花瓣基部白色，具纵向紫色条纹；果实果尖向上，在果实刚形成时，果尖为紫色，其余部分为绿色，果实在生长过程中从尖端向中部、基部由绿变紫，青熟时呈浓郁、亮丽的紫色，老熟时呈红色，即在发育过程中，果色表现绿紫→淡紫→浓紫→红的规律性变化。可见，‘文紫椒1号’叶、茎、花和果可形成以紫为主要色相，清新淡雅，能表达神秘、冷静和浪漫等情感的紫色审美客体[3]，极具观赏价值。

研究表明，辣椒果色取决于其果皮中色素的组合和组织定位。果实的绿色源于叶绿素(chlorophyll，Chl)，紫色源于属于黄酮类(flavonoid，Fla)的花色苷(anthocyanin，AN)，且最主要的AN为花翠素3-反式香豆酰芦丁糖苷-5-葡萄糖苷，花翠苷分子中B环上的邻位三羟基结构决定了果实的紫色，花翠素C3位上反式香豆酰基通过分子内共色效应赋予该花翠苷在细胞中拥有足够的稳定性，Fla多为淡黄、黄色，而橙红色则源于类胡萝卜素(carotenoid，Car)类，主要为辣椒红素(capsanthin，Cap)等[4-6]。

但是，不同发育阶段‘文紫椒1号’果实呈色的色素组合和组织定位迄今未见报道。笔者探究‘文紫椒1号’紫色果实在不同发育阶段的Chl、Fla、AN和Car的含量配比及果皮中色素的组织定位[5]，旨在为丘北辣椒在观赏园艺中的应用和观赏型新奇果色新品种的选育提供参考[7]。

1 材料与方法

1.1 大田试验和材料的采集与预处理

2019年4月26日，在文山州砚山县江那镇子马社区（104°21'28″E，23°35'12″N，平均海拔1541.90 m）完成‘文紫椒1号’苗的垄作式移栽，垄的长、宽和高分别为10 m、1 m和10 cm，株行距为45 cm×50 cm，垄上覆盖银灰色塑料农膜；7月15日和8月2日，分别随机采集开花结果期、健康的植株12株，将其假植于塑料桶中，加土和水适量。在室内，据果长并结合老熟期红色果色将果实分为5个发育阶段，即长0.0～1.5、1.5～3.0、3.0～4.5、4.5～6.0 cm及老熟的红色果实；将果实随机分为2批，一批在冰上纵剖为两半，剔取果皮，加液氮研磨成粉，冻存于-80℃备用于色素含量的检测，另一批在果实纵向中部进行徒手横切、镜检色素的组织定位。

1.2 果实色素含量配比的测定

1.2.1 色素含量的测定

（1）Chl和Car含量。果实的Chl含量([Chl])和Car含量([Car])用比色法测定，参考文献[8]操作并略作修改。取果皮粉1.0000 g，加5～7 mL 80% CH3COCH3快速研磨成匀浆，滤入预先以铝箔包裹的25 mL容量瓶，用80% CH3COCH3冲洗滤渣、定容，用“T6新世纪”紫外-可见分光光度计（北京普析通用有限责任公司）检测滤液的A663.0、A646.0和A470.0，以鲜重(fresh weight，FW)计算果实的[Chl]和[Car]。

（2）总黄酮类含量。果实的总黄酮类含量(total flavonoid content，TFC)用 AlCl3比色法测定[9]，以芦丁(rutin,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)为标样[10]；取果皮粉0.5000 g，加25 mL 60% C2H5OH[11]，在85℃水浴加热2 h；取出冷却，过滤、定容至50 mL；取5 mL滤液，加1 mL 10% NaNO2；5 min后，加1 mL 10% AlCl3·6H2O；10 min后，加8.0 mL 10% NaOH；静置15 min后测反应液的A510.0；TFC 用标准曲线方程 Y=0.8268X+0.0068[R²=0.9996，Y为A510.0，X为芦丁浓度(μg/mL)]计算，表示为“mg rutin equivalent(RE)/(g·FW)”。

（3）总花色苷含量。果实的总花色苷含量(total anthocyanin content，TAC)以色价度量[12-13]；取果皮粉0.5000 g，加含1% HCl(v/v)的CH3OH 30 mL研磨成匀浆，滤入以铝箔包裹的50 mL容量瓶，定容，计算如式(1)[14]。

式中，A539.0和A657.0分别表示在539.0 nm和657.0 nm处的吸光值。

（4）Cap含量。果实的Cap含量([Cap])参照《食品添加剂辣椒红》(GB 10783—2008)以及文献[15]和[16]测定。取果皮粉1.0000 g，加CH3COCH3（含0.1%2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）约20 mL研磨成匀浆，定容至100 mL。果实[Cap]表示为

1.2.2 色素含量配比的计算 果实的色素含量配比，即[Chla]/[Chlb]、[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC、[Chl(a+b)]/TAC、[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]，均据各色素的含量计算。

1.3 果实色素组织定位的检测

果实色素的组织定位用Zeiss蔡司Primo Star（北京汗盟紫星仪器仪表有限公司）基于徒手切片检测，镜检果实纵向中部横切片，据色相（绿、紫和橙红）和色度判断色素的定位和积累量[17-18]。

1.4 数据分析

生物学重复和含量检测均重复2次；双因素相关分析用SPSS 20.0完成。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段‘文紫椒1号’果实的色素组合特征

2.1.1 [Chla]/[Chlb]特征在阶段3，‘文紫椒1号’果实的[Chla]/[Chlb]最大，约为3.137，分别比阶段1、2、4、5的[Chla]/[Chlb]约高18.83%、20.12%、0.34%、168.79%，而且，阶段1的[Chla]/[Chlb]接近阶段2的，阶段3的[Chla]/[Chlb]又接近阶段4的（图1）。可见，从阶段1到3时，果实的蓝绿色加深，到阶段4时，蓝绿色仍较稳定，从阶段4到5（即老熟期）时，[Chla]/[Chlb]降至最低，果实由蓝绿转向黄绿（图2A）；但是，果实在阶段1到4时的蓝绿均被AN的紫色掩盖，阶段5的黄绿则被Car的红色掩盖。

图1 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的叶绿素a/b和[叶绿素(a+b)]/[类胡萝卜素]

2.1.2 [Chl(a+b)]/[Car]特征在阶段2，‘文紫椒1号’果实的[Chl(a+b)]/[Car]最大，约为3.992，分别比阶段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/[Car]约高11.63%、3.54%、19.41%、11607.62%（图1）。可见，果实在阶段2和5时分别最绿、最红（图1，图2A、B、E），但绿色被AN的紫色掩盖。

2.1.3 [Chl(a+b)]/TFC特征在发育过程中，‘文紫椒1号’果实的[Chl(a+b)]/TFC的变化趋势与[Chl(a+b)]/[Car]的相似（图1、3）；阶段2的[Chl(a+b)]/TFC也最大，约为0.011，分别比阶段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TFC约高9.28%、2.91%、9.28%、381.82%（图3）。可见，在阶段1～4时，Fla导致的（淡）黄色的变幅较小，且（淡）黄色被Chl的绿色和AN的紫色掩盖，而在阶段5时，（淡）黄色则贡献于果实的老熟果色（图2C）。

图2 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的色素含量

图3 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的[叶绿素]/[总黄酮类]

2.1.4 [Chl(a+b)]/TAC特征在阶段2，‘文紫椒1号’果实的[Chl(a+b)]/TAC最大，约为0.290，分别比阶段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TAC约高 5.87% 、36.36%、141.51%、402.25%（图4）。可见，在阶段1和2时，果实因AN合成和积累较少而表现紫绿和绿变紫；从阶段3到4时，果实因AN合成和积累量不断增加而表现为紫色越来越浓；在阶段5时，Chl和AN均迅速降解，不再贡献于老熟期的果色（图2A、D）。

2.1.5 [Chl(a+b)]/[Cap]特征在阶段1，‘文紫椒1号’果实的[Chl(a+b)]/[Cap]最大，约为0.521，分别比阶段2、3、4、5 的 [Chl(a+b)]/[Cap]约 高 38.84% 、32.22% 、256.71%、10316.00%（图4）。可见，在阶段4时，果实Cap合成量开始明显增加，但Cap的红色被Chl的绿色和AN的紫色掩盖；在阶段5时，Cap合成量最大，同时Chl和AN大量、迅速降解，果实主要展示Cap的红色（图2A、E，图4）。

图4 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的[总叶绿素]/[总花色苷]和[叶绿素]/[辣椒红素]

2.1.6 TFC/TAC特征从阶段1到4，‘文紫椒1号’果实的TFC/TAC持续下降至最低值，即从约28.20下降至约12.34；从阶段4到5，TFC/TAC重新上升至约接近阶段2时的水平（图5）。可见，在阶段3至4时，果实Fla主要为AN而导致果实的紫色在阶段4最浓，而阶段5时TFC/TAC的上扬应与老熟期果实中AN的大量、快速降解有关；在整个发育过程中，Fla主要充当AN的共色素而稳定AN的紫色[19]（图2C、D，图5）。

2.1.7 TFC/[Cap]特征在发育过程中，‘文紫椒1号’果实的TFC/[Cap]的变化趋势与[Chl(a+b)]/[Cap]的相似（图4～5）。在阶段1，果实的TFC/[Cap]最高，约为53.57，分别比阶段2、3、4、5的TFC/[Cap]约高51.10%、40.26%、257.43%、2246.42%（图5）。可见，在阶段1至4时，果实TFC/[Cap]维持在较高水平，但呈现下降趋势，在阶段5时，Cap合成量剧增，故TFC/[Cap]骤降至最低（图2C、E，图5）。

图5 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的[总黄酮类]/[总花色苷]和[总黄酮类]/[辣椒红素]

2.1.8 TAC/[Cap]特征在发育过程中，‘文紫椒1号’果实的TAC/[Cap]的变化趋势与[Chl(a+b)]/[Cap]和TFC/[Cap]的相似（图4～6）。在阶段1，果实的TAC/[Cap]最高，约为1.90，分别比阶段2、3、4、5的TAC/[Cap]约高47.04%、2.65%、56.35%、2085.73%（图6）。可见，在阶段1至4时，果实TAC/[Cap]波动式维持在较高水平，在阶段5时，Cap合成量加剧，导致TFC/[Cap]骤降至最低（图2E，图6）。

图6 ‘文紫椒1号’果实在不同发育阶段的[总花色苷]/[辣椒红素]

2.2 不同发育阶段‘文紫椒1号’果实色素的组织定位特征

‘文紫椒1号’果实果皮横切面上细胞群的呈色模式表明，果色相关色素主要定位在中果皮细胞中；在果实发育中，果皮细胞群的色相和色度变化趋势与果色的高度一致（图7）。在阶段1，绿色的Chl和较少的紫色AN主要集中于中果皮细胞中；阶段2～4，紫色的AN在中果皮、外果皮细胞中的积累量增加，AN同时向内果皮扩展，将Chl的绿色完全掩盖，该现象与积累AN的绿色叶片的呈色恰好相反[20]，到阶段4时，外、中和内果皮成片呈紫褐色；在阶段5时，外、中和内果皮中紫色的AN和绿色的Chl快速消失，果皮显示Car的橙红色[21]（图7）。

图7 不同发育阶段‘文紫椒1号’果实果皮中色素的组织定位和积累量

2.3 ‘文紫椒1号’果实在发育过程中[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相关性特征

Pearson相关系数（表1）表明，在发育过程中，‘文紫椒1号’果色色素含量之间呈不同的相关性。其中，[Chla]与[Chlb]之间、[Chla]与[Chl(a+b)]之间、[Chlb]与[Chl(a+b)]之间以及[Car]与[Cap]之间均呈极显著正相关；[Chla]与TFC、TAC之间，[Chlb]与TAC之间，[Chl(a+b)]与TAC之间，[Car]与TFC之间以及TFC与TAC、[Cap]之间均呈不显著正相关；[Chlb]与[Car]之间呈极显著负相关；[Chla]与[Car]、[Cap]之间，[Chlb]与[Cap]之间以及[Chl(a+b)]与[Car]、[Cap]之间均呈显著负相关；[Chlb]与TFC之间、[Chl(a+b)]与TFC之间、[Car]与TAC之间以及TAC与[Cap]之间均呈不显著负相关。

3 结论与讨论

作为丘北辣椒紫色品种的典型代表，‘文紫椒1号’的果色在果实发育过程中呈现由绿变紫，最终由紫快速变红，极具观赏价值的规律性变化[2]，但该品种果色色素的组合和组织定位特征迄今未见报道。通过将‘文紫椒1号’果实的发育过程分为5个阶段，本研究发现，在‘文紫椒1号’果实发育中，果实[Chla]/[Chlb]的最大值出现在发育阶段3，[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC和[Chl(a+b)]/TAC的均出现在阶段2，而[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]的均出现在阶段1（图1）；[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相关性不尽一致，其中，TAC与[Chl(a+b)]、TFC之间均呈不显著正相关，而与[Car]之间呈不显著负相关，[Cap]则与[Chl(a+b)]、[Car]、TFC和TAC之间分别呈显著负相关、极显著正相关、不显著正相关和不显著负相关（表1），这与文献[5]报道的结果不完全一致，意味着‘文紫椒1号’果色随果实发育阶段的变化在色素组合层面具备特殊性；同时，果色色素主要定位在中果皮细胞中，在果实发育中，果皮细胞的色相和色度变化趋势与果色的高度一致（图7）。所以，‘文紫椒1号’的果色源于果皮细胞Chl、Car（含Cap）和Fla（含AN）色素的发育阶段差异性组合。但是，本研究暂未探究‘文紫椒1号’果实Chl、Fla、AN、Car和Cap合成、降解相关的关键结构基因和调节基因种类及其果实发育阶段依赖性表达模式，所以，挖掘这些结构基因和以转录因子基因为代表的调节基因，澄清其在果实发育过程中的表达动态和调控网络，将有望在基因层面明确果色色素代谢对‘文紫椒1号’等丘北辣椒果色的决定及其对辣椒产量和品质形成的效应[22]。

表1 ‘文紫椒1号’果实在发育过程中各色素含量间的Pearson相关系数

近年来，丘北辣椒已成为云南文山州的经济支柱产业之一[23]，在全州乃至全省经济发展、乡村脱贫致富和振兴方面发挥着重要作用，但是，丘北辣椒长期以来主要作为蔬菜类经济作物创造效益。事实上，300余年来，器官颜色的丰富变化一直是丘北辣椒地方特色的重要内涵和表现之一[24]。目前，丘北辣椒观赏价值的开发与利用已见端倪。以‘文紫椒1号’为代表的丘北辣椒紫色品种极具观赏性的属性有望从观赏园艺作物开发的角度为丘北辣椒产业链的延伸和经济效益的提升打开一个新的视角。具体而言，‘文紫椒1号’紫色的叶、茎、花和果，尤其是变化的果色，可构建成清新淡雅、神秘浪漫的审美客体，同时具备观叶、观花和观果价值[3]，可用于室内和庭院摆放以及公园绿化、花坛、花境和现代农业观光园等的布置[7,25]。可见，以紫果为代表的表型可实现丘北辣椒从传统、单纯的蔬菜用经济作物向观赏型经济作物的转型，从而拓展、提升丘北辣椒的社会、经济价值。