鸡滑液囊支原体贵州株的分离鉴定及VlhA基因序列分析

宋 春，王柏林，李 梅，文 明,2，王开功,2，陈常秀，程振涛,2

（1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳 550025；3.临沂大学农林科学学院，临沂 276005）

鸡滑液囊支原体（Mycoplasmasynoviae，MS）对禽类产业危害严重，感染率呈现居高不下的趋势[1-2]。鸡滑液囊支原体病大多是慢性和持续性感染，主要影响关节滑膜囊、腱鞘和足垫肿胀，导致渗出性炎症。此外,该病还会造成生长缓慢、饲料转化率低、降低产蛋量和品质等[3-4]。该病可水平或垂直传播，鸡场一旦被感染，就很难彻底净化[5]。MS与其他病原微生物混合感染会导致病情变得复杂严重，死亡率大大增加[6]。但目前并没有针对MS的特效药，唯一获得生产许可的活疫苗MS-H株对已感染鸡群没有保护作用且会定植于呼吸道，破坏黏膜从而利于其他病原侵入感染[7-8]。近年来，中国很多地区不同品种鸡群都存在MS感染[9-10]。丁美娟等[11]对江苏省部分地区MS感染情况调查结果显示，平均阳性率为57.7%，最高达82.4%，最低为38.9%。陈秀红等[12]对宁夏5个地区鸡场MS感染进行血清学调查结果显示，各地区血清抗体阳性率为46.23%～89.67%，提示宁夏地区存在严重的MS感染。

虽然MS是单一血清型，但在菌株的毒力和致病性上表现出差异，部分菌株仅导致呼吸道的亚临床感染，发病率低；但部分菌株可引起严重关节症状，发病率高，严重影响生产力[13-14]。鉴于此，对不同地区MS的分离显得尤为重要。MS的VlhA基因编码的血凝素蛋白是参与禽类支原体定植和毒力的最重要的表面蛋白之一，翻译后被切割成脂蛋白（MSPB）和血凝素蛋白（MSPA），具有很强的抗原变异性[15]。VlhA基因主要通过表达和假基因转换机制发生大小和阶段变化，根据VlhA基因序列的变异程度可分为3个主要区域：保守区域、半可变区域和高度可变区域[16]。VlhA基因是近年来MS新型诊断方法和遗传进化分析的热点基因。李凡等[17]对从川西地区养鸡场采样分离的MS进行VlhA基因遗传进化分析显示，川西地区养鸡场的MS感染率很高,且变异较大。贵州大学动物科学学院实验室前期调查发现，贵州省已有不少养鸡场存在MS感染[18]，但对MS贵州株的分离鉴定相关研究很少。本研究从贵州省某养鸡场疑似MS感染病例中共采集107份样品进行MS的分离培养及鉴定，以期了解贵州省MS流行株的生物特性及变异情况，为贵州省MS防控研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

MS标准株（GX11-T）购自中国兽医药品监察所；改良Frey氏培养基购自中海生物科技有限公司；葡萄糖、麦芽糖、尿素、精氨酸等生化试剂管均购自贵阳宏硕生物试剂公司；2×TaqPCR Mix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker购自Omega公司。

1.2 MS感染阳性样本筛选

1.2.1 疑似MS感染病例临床症状观察 2019年9月中旬，贵州省织金县某养殖场30日龄白羽肉鸡出现关节、脚垫肿胀，不愿走动等疑似MS感染症状。抓取典型症状病鸡，无菌采集咽喉拭子、肿胀关节、脚垫组织及肿胀组织渗出物。

1.2.2 MS阳性样本筛选 基于MSVlhA基因（GenBank登录号：AF085697.1）应用 Primer Premier 5.0软件设计1对特异性检测引物，引物序列为:MS-F1：5′-TCCAACAACAACGCAAAC-3′；MS-R1：5′-TAGGCATAAACCCGTCTC-3′，预期扩增片段大小为286 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取少量组织样品研磨稀释后离心过滤取滤液；渗出液稀释、离心后取上清；咽拭子置于生理盐水中震荡混匀后取上清。参照DNA提取试剂盒说明书提取样本总DNA并以此为模板进行PCR反应。PCR反应体系25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 MS阳性样本的分离与鉴定

1.3.1 MS阳性样本的分离培养及形态观察 对PCR筛选出的阳性样本进行MS分离培养。将少量阳性样本组织研磨、稀释（方法同1.2.2），取上清用改良Frey氏培养液于37 ℃恒温箱中进行培养，颜色变橙黄时涂布于Frey氏平板继续培养，有菌落生长时于倒置显微镜下观察有无中央凸起呈“煎蛋状”的典型支原体菌落，挑取单菌落到新培养液中培养至颜色变黄，离心后将沉淀物用瑞氏染色并于显微镜下观察菌体形态。

1.3.2 分离株的生化鉴定试验 参考丁美娟[19]方法，根据观察的菌体及菌落，将可疑菌液接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、精氨酸、尿素生化鉴定管，密封生化管后置于37 ℃恒温箱培养，观察颜色变化。

1.4 分离株VlhA基因PCR扩增及序列分析

提取疑似MS分离株的DNA，基于MSVlhA基因（GenBank登录号：AF085697.1）设计引物扩增VlhA基因。引物序列为:MS-F2：5′-GCCATTGC-TCCTGCTGTTATA-3′；MS-R2：5′-GGGTAGT-CCACTCGCATT-3′，预期扩增片段大小为821 bp。 PCR反应体系50 μL：2×TaqPCR Mix 25 μL，DNA模板4 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2 μL，ddH2O 17 μL。 PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段进行胶回收后用pMD19-T载体克隆，筛选阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，再用MegAlign分析测序结果与GenBank中13株参考株VlhA基因序列的相似性，并构建遗传进化树。参考毒株信息见表1。

表1 参考菌株信息Table 1 Reference strains information

2 结 果

2.1 疑似MS感染病例临床症状及剖检病变

对疑似MS感染病鸡进行临床症状观察，主要表现为关节脚垫肿胀、龙骨肿胀、站立不便等；对疑似MS感染鸡进行剖检病变观察，病鸡肿胀关节切开有半透明液体渗出、龙骨肿胀切开有黄色干奶酪样渗出物，同时其他脏器病变不明显。病鸡呈MS感染典型症状。

2.2 MS阳性样本筛选结果

107份样本中初步筛选出20份MS阳性样本，阳性率为18.7%，阳性样本中肿胀关节5份，足垫6份，肿胀渗出物6份，咽拭子3份。部分扩增结果见图1。

2.3 MS阳性样本的分离培养及形态观察结果

对阳性样本进行培养，在Frey氏液体培养基中培养后液体变黄且清亮，在Frey氏固体平板上培养5 d后在显微镜下观察到中间凸起的“煎蛋状”菌落（图2A）。 瑞氏染色疑似MS分离培养物可见细小的球形或椭圆形分离菌体（图2B）。

图2 分离菌株的菌落形态（A）和瑞氏染色（B,1 000×）观察Fig.2 Observation of colony morphology （A） and Wright staining （B,1 000×） of the isolated strains

2.4 分离株生化鉴定结果

生化鉴定结果显示，该疑似MS分离株能发酵葡萄糖和麦芽糖，不能发酵乳糖和蔗糖，不能分解尿素、甘露醇和精氨酸（表2）。

表2 疑似MS分离株生化试验结果Table 2 Biochemical test results of suspected MS isolate

2.5 分离株VlhA基因PCR扩增结果

以提取的分离株DNA为模板,PCR扩增VlhA基因，得到目的条带大小为821 bp（图3），与预期相符，表明分离株为MS,命名为GZ-ZJ。

M,DL2000 DNA Marker；1，疑似MS样本；2，阴性对照；3，阳性标准株M,DL2000 DNA Marker；1，Suspected MS sample；2，Negative control；3，Positive standard strain图3 VlhA基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification result of VlhA gene

2.6 分离株VlhA基因核苷酸相似性分析

将测序正确的重组质粒VlhA基因序列与GenBank中13株参考株序列用MegAlign软件进行相似性分析。由图4可知，分离株GZ-ZJ与国内不同地区流行株VlhA基因相似性具有地域差异。分离株GZ-ZJ与安徽、湖南、湖北、江苏、重庆、福建、广东、广西和云南等地区MS流行株VlhA基因的相似性在90.3%～99.7%之间。与湖南MS流行株相似性最高，达到99.7%。与斯洛文尼亚和突尼斯流行株相似性最低，为78.7%和87.3%，与鸡毒支原体（Mycoplasmagallisepticum，MG）VlhA基因的相似性仅为27.9%，结果进一步表明该分离株为MS，且存在一定变异。

图4 分离株VlhA基因核苷酸相似性分析Fig.4 Nucleotide similarity analysis of VlhA gene of the isolate

2.7 分离株VlhA基因遗传进化树分析

由图5可知，该分离株GZ-ZJ与安徽、湖南、湖北、重庆、江苏、福建、广东、广西和云南等地MS流行株VlhA基因处于同一大分支上，亲缘关系很近；尽管和斯洛文尼亚的MS流行毒株属于同一个分支，但亲缘关系相对较远；与MG则处于不同分支。表明该分离株是MS，而不是MG。

图5 分离株VlhA基因遗传进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of VlhA gene of the isolate

3 讨 论

MS可引起鸡关节、爪垫肿大及滑囊炎、腱鞘炎，使肉鸡饲料转化率低、生长受阻，蛋壳顶点异常综合征[20]。近年来，贵州省大力发展林下养鸡、茶园养鸡等模式，不同鸡群中出现疑似MS流行。MS的诊断方法主要包括病原的分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，但对于确诊MS感染，分离鉴定是业内普遍认可的“金标准”[17]。MS临床分离率普遍低，本研究对贵州省MS进行分离，但仅从肿大关节和足垫处分离到1株MS，低于徐引弟等[21]分离的25株MS，石晓磊[7]从肿胀的跗关节分离到13株MS。分析可能是鸡场曾使用药物治疗导致组织中MS已被清除，且MS多呈慢性感染,组织中活菌数量较少导致PCR未检测出来，此外混合感染的细菌、支原体等其他病原干扰MS生长也是分离率低的重要原因。对比前人研究[17，21-22]，在今后分离MS时应改进一些试验方法，采取发病初期且未经治疗的病鸡肿大爪垫和关节病料，直接用Frey液体培养基培养，待培养液变黄再用含氨苄的Frey固体平板培养分离MS，可避免活菌数量少、PCR检测不出来的情况，也可减少混合感染的部分病原对MS生长带来的影响。同时检测常与MS混合感染的大肠杆菌、鸡毒支原体等病原，以排除其他病原的混合感染。虽然本次MS分离率低，但实际感染情况十分严重，对贵州省养鸡业危害巨大，应当引起重视。

MS的血凝素蛋白VlhA基因保守的5′-端包括编码脯氨酸重复序列的串联重复序列和高度多态性区域（RⅢ），适合菌株分型，是MS遗传进化分析的热点靶基因[23-24]。本研究对MS分离菌VlhA基因保守片段进行核酸相似性和遗传进化树分析，结果显示，该分离株VlhA基因与国内其他地区MS流行株VlhA基因处于同一大分支上，亲缘关系很近，与湖南MS流行株KU572320.1相似性最高，达到99.7%；与国外斯洛文尼亚和突尼斯流行株亲缘关系相对远。说明贵州省织金县肉鸡场分离的MS存在一定的变异，且是由国内流行株变异而来。

动物回归试验是鉴定工作重要的一环。动物试验可直接观察到滑液囊支原体引起的临床症状和病理变化，从攻毒试验动物中重新分离到MS。但也受MS分离菌的毒力强弱或注入浓度、感染途径差异等影响，其试验动物的发病率和临床病理变化也不同，从而影响鉴定工作的准确度[25-26]。本研究前期做动物回归试验，从足垫、气管注射感染，但鸡临床症状不明显，可能与MS分离株毒力有关，后期研究将增加菌株数量来逐步补充。

4 结 论

本研究分离到1株MS，在平板上生长出“煎蛋状”菌落，能分解葡萄糖和麦芽糖，VlhA基因的序列分析显示，该分离株与国内参考株相似性为90.3%～99.7%，表明该分离株存在一定变异。