绵羊MyoG基因内含子Ⅱ多态性及其与生长性状的关联分析

李静云，王新乐，张云飞，白俊艳，2，李 淦，2，雷 莹，2，董智豪，陈 宇，樊红灯，王龙威，陈梦柯，王兴科，司马磊阳，张世文

（1.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471023；2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，洛阳 471023）

肌细胞生成素（myogenin，MyoG）基因是生肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族的一员，主要参与调控肌肉的生长[1]，诱导骨骼肌细胞的增殖、分化与融合[2]，以及调控骨骼肌的发育、成熟、损伤后的修复[3]。鸡MRF4和MyoG基因共表达参与了骨骼肌细胞终末分化[4]。虽然MyoG基因在成年动物中表达量较低，但仍是调节骨骼肌有氧代谢和无氧代谢之间能量平衡的重要因素[5]。MyoG基因与生长性状、胴体性状和肉质性状都有密切的关系[6-8]。Tepas等[9]研究表明，在梅山猪、荷兰长白猪和杜洛克猪的MyoG基因中存在3个突变位点：梅山猪中检测出突变位点1和2，荷兰长白猪和杜洛克猪中检测出突变位点2和3。王健等[10]对太湖鹅MyoG基因外显子Ⅰ进行多态性分析，共发现HH、HI和II 3种基因型，且II基因型显著影响太湖鹅的早期增重。郭琳等[11]研究表明，在三江黄牛Dickkopf蛋白家族成员（DKK1和DKK4）基因中各检测到2个突变位点，但MyoG基因未检测到多态位点。王琼等[12]研究表明，在优质肉鸡MyoG基因5′-调控区存在A、B 2个多态位点，与胸肌重、胸肌率、腿肌重及腿肌率均呈显著相关。柴志欣等[13]研究显示，牦牛MyoG基因中共发现T757C、G662A、A539G和A2216G 4个突变位点，均存在3种基因型；关联分析表明，T757C、G662A、A539G位点与体高显著相关。 彭邦星等[14]研究表明，兴义鸭MyoG基因中共发现g.238 G>C、g.397 C>G、g.8 C>T、g.23 G>A、g.47 G>A、g.74 C>T及g.104 G>C 7个SNPs位点，其中g.238 G>C位点与胸肌率呈显著关联，g.8 C>T和g.104 G>C位点与全净膛率呈显著关联，g.104 G>C位点与全净膛重呈显著关联。综上所述，MyoG基因对动物的生长、发育及繁殖有着重要作用。鉴于此，本研究以大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊5种绵羊为研究对象，利用PCR-RFLP技术对5个绵羊群体MyoG基因内含子Ⅱ的多态性进行分析，并分析了其与绵羊生长性状的关联性，以期为绵羊生长性状相关的分子标记选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和指标测定

选取河南省平顶山市宝丰县农户的大尾寒羊58只、河南省台前县农户小尾寒羊52只、河南省洛阳市偃师区和伊川县农户的豫西脂尾羊36只、河南省洛阳市肉羊产业技术体系洛阳综合试验站湖羊34只、河南省洛阳市马坡镇鲜达牧业杜泊羊37只，共计试验绵羊217只。颈静脉采血10 mL，ACD抗凝处理（血液与ACD为5∶1（V/V）），置于冰盒中快速带回实验室，-20 ℃保存备用。

使用测杖、卷尺、电子秤等工具测定试验绵羊的生长性状指标：宰前活重、体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰角宽、臀端宽、臀端高、管围、背高、胴体重、尻高、尻长、头长、头深、颈长、额宽、腹围及腿臀围等，测定方法参考《家畜育种学》[15]。

1.2 主要试剂

全血基因组DNA试剂盒购自无锡百泰克生物技术有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、全血基因组蛋白酶K、限制性内切酶Eco72 Ⅰ均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；琼脂糖购自上海惠兴生化试剂有限公司。

1.3 基因组DNA提取

取出绵羊血样解冻后，根据DNA提取试剂盒说明书提取绵羊血液DNA，用超微量核酸浓度测定仪检测DNA的浓度和纯度，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。D260 nm/D280 nm值在1.65～1.85之间说明DNA样品较好，根据DNA样品纯度和浓度将DNA稀释至100 ng/μL，分装至EP管中，-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计与合成

参考刘铮铸等[16]设计MyoG基因内含子Ⅱ引物序列：F：5′-TCTTCCCTCTTCCCTTATTC-3′；R:5′-GTCCCTTGCTTTATCTCC-3′，预计扩增片段大小为908 bp。引物由郑州鼎国生物技术有限公司合成。

1.5 PCR扩增

PCR扩增体系15 μL：上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取扩增产物5 μL经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察扩增结果，并拍照保存。

1.6 PCR-RFLP分析

酶切反应体系20 μL：PCR产物10 μL，10×Buffer 2 μL，Eco72 Ⅰ（10 000 U/mL） 0.2 μL，ddH2O 7.8 μL。在数显恒温水浴锅中酶切3 h。取酶切产物5 μL经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察酶切分型结果，并拍照保存。

1.7 统计分析

利用PopGene32软件整理计算MyoG基因内含子Ⅱ的基因型频率、基因频率及杂合度、多态信息含量、有效等位基因数等群体遗传多态性。利用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析（One-Way ANOVA）对MyoG基因内含子Ⅱ多态性与绵羊生长性状进行关联分析。分析模型如下：

yijk=μ+Si+Mj+Dk+eijk

式中，yijk为性状表型值；μ为总体均值；Si为性别效应（i=1，2）；Mj为第j个基因型效应；Dk为第k个月龄效应（k=2、4、6、8、10、12）；eijk为残差效应。

结果用平均值±标准差来表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的PCR扩增

绵羊MyoG基因内含子Ⅱ PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。 由图1可知，电泳条带清晰、单一无杂带，片段长度约为908 bp，与目的片段大小相符，可满足后续试验要求。

1、2，大尾寒羊；3、4，小尾寒羊；5、6，豫西脂羊；7、8，杜泊羊；9、10，湖羊;M，DL2000 DNA Marker1 and 2，Large-tailed Han sheep；3 and 4，Small-tailed Han sheep；5 and 6，Yuxi Fat-tailed sheep；7 and 8，Dorper sheep；9 and 10，Hu sheep;M，DL2000 DNA Marker图1 绵羊MyoG基因内含子ⅡPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR products of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

2.2 绵羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP分析

大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊MyoG基因内含子ⅡEco72 Ⅰ位点酶切分型结果见图2～6。由图2～6可知，酶切产物检测到3种基因型：AA（368/540 bp）、AB（908/368/540 bp）及BB（908 bp），其中MyoG基因内含子ⅡEco72 Ⅰ位点在小尾寒羊、杜泊羊、湖羊群体中检测到AA、AB、BB 3种基因型，而在大尾寒羊和豫西脂尾羊群体中仅检测到AB和BB 2种基因型，没有检测到AA基因型。

1、2、4、5、7，AB基因型；3、6，BB基因型;M，DL2000 DNA Marker1，2，4，5 and 7，AB genotype；3 and 6，BB genotype;M，DL2000 DNA Marker图2 大尾寒羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP结果Fig.2 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Large-tailed Han sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、4和6，AB基因型；2、3，AA基因型；5，BB基因型M，DL2000 DNA Marker；1，4 and 6，AB genotype；2 and 3，AA genotype；5，BB genotype图3 小尾寒羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP结果Fig.3 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Small-tailed Han sheep

1～5、7～9，AB基因型；6，BB基因型;M，DL2000 DNA Marker1-5 and 7-9，AB genotype；6，AB genotype;M，DL2000 DNA Marker图4 豫西脂尾羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP结果Fig.4 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Yuxi Fat-tailed sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、3、4和6，AB基因型；2、9，BB基因型；5、7和8，AA基因型M，DL2000 DNA Marker；1，3，4 and 6，AB genotype；2 and 9，BB genotype；5、7 and 8，AA genotype图5 杜泊羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP结果Fig.5 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Dorper sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、7和8，AA基因型；2、6：BB基因型；3～5，AB基因型M，DL2000 DNA Marker；1，7 and 8，AA genotype；2 and 6，BB genotype；3-5，AB genotype图6 湖羊MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点的PCR-RFLP结果Fig.6 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Hu sheep

2.3 绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的群体遗传学分析

5个绵羊群体MyoG基因内含子Ⅱ的基因型频率和基因频率见表1。由表1可知，大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊均以AB为主要基因型，基因型频率分别为0.845、0.633、0.917、0.706及0.811，大尾寒羊和豫西脂尾羊未检测到AA基因型；小尾寒羊和杜泊羊的A等位基因频率分别为0.650和0.541，要高于B等位基因频率；而大尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊的B等位基因频率分别为0.575、0.542、0.529，要高于A等位基因频率。卡方检验发现，只有湖羊符合哈代-温伯格平衡状态（P>0.05），其他4种绵羊群体均显著偏离哈代-温伯格平衡状态（P<0.05）。

表1 绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的基因型频率和基因频率Table 1 Genotype frequency and gene frequency of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

5个绵羊群体MyoG基因内含子Ⅱ的群体遗传学参数见表2。由表2可知，小尾寒羊的杂合度最低为0.455，杜泊羊的杂合度最高为0.497。5个绵羊群体中的有效等位基因数为1.835～1.992，多态信息含量（PIC）均为中度多态（0.25

表2 绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的遗传多样性Table 2 Genetic diversity of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

2.4 MyoG基因内含子Ⅱ与绵羊生长性状的关联分析

由表3可知，绵羊MyoG基因内含子Ⅱ BB基因型个体胸围、胸宽、头长、颈长均显著低于AA和AB基因型（P<0.05）；AA基因型个体宰前活重、体高、体长、臀端高、腰角宽、腿臀围等性状有高于BB基因型的趋势，但差异均未达到显著水平（P>0.05）。

表3 MyoG基因内含子Ⅱ与绵羊生长性状的关联分析Table 3 Association analysis between MyoG gene intron Ⅱ and growth traits in sheep

3 讨 论

3.1 MyoG基因的多态性

随着生活水平的提高，人们对于畜产品需求加大，通过传统的饲料利用率、转化能力来提高家畜生长速度、肉品质的方式已无法满足当前的需要。生长性状作为一项评定个体选育潜力的数量性状，常常用于动物优良个体的早期选育过程中[17]。利用标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）可以筛选出与动物生长性状相关的主效基因，能够极大地提高低遗传力性状的选择效率，加快人工育种速度，培育出遗传性能稳定、性能良好的种畜[18]。目前，已有很多研究者对生长性状相关基因的多态性进行了测定，并筛选出影响动物生长性状的相关候选基因，如生长激素（GH）[19]、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）[20]、血管活性肠肽Ⅰ型受体（VIPR-1）[21]及生长激素促分泌素受体（GHSR）[22]等。

MyoG基因是动物生长发育过程的重要调节因子，对于动物的肌肉形成具有重要作用，因此，MyoG基因对生产性状的影响也成为一个分子标记辅助选择的研究热点。脊椎动物的MyoG基因结构相似，包括3个外显子和2个内含子[23]。刘永斌等[24]研究发现，MyoG基因外显子1在4个绵羊品种中发现3种基因型：AA、BB和AB，但只有BB基因型在德国肉用美利奴羊中未检测到。孙奴奴等[25]研究表明，MyoG基因在晋汾白猪和新山西黑猪中均检测到AA、AB、BB 3种基因型，晋汾白猪的优势基因型AA可用于人工选育出优秀猪种，而新山西黑猪则恰恰相反，其优势基因型BB在人工选育时表现出更大的优势。魏天等[26]研究显示，在小尾寒羊MyoG基因外显子1中发现1处突变位点C211T，经Chromas软件比对分析发现3种基因型：AA、BB及AB，A等位基因频率为0.706，属于优势等位基因。白俊艳等[27]研究发现，MyoG基因外显子1在6个绵羊群体中存在3种基因型（AA、BB、AB）和2个等位基因（A、B）。姚毅等[28]研究显示，在波尔山羊和成都麻羊MyoG基因内含子1中发现1个SNP位点C422T，存在3种基因型（AA、BB、AB）和2种等位基因（A、B）。刘铮铸等[29]研究发现，波尔山羊MyoG基因由3个外显子、2个内含子及部分5′-UTR（74 bp）和3′-UTR（260 bp）构成。韩银仓等[30]研究显示，MyoG基因外显子Ⅰ上存在1个A109C的突变位点，该突变导致37位的谷氨酸（GAG）错义突变为丙氨酸（GCG），经测序比对发现3种基因型：CC、CA及AA，其中CC为优势基因型，C为优势等位基因；河南县欧拉型藏羊、祁连县高原型藏羊群体均处于哈代-温伯格平衡状态，贵南县黑藏羊群体处于哈代-温伯格不平衡状态。刘铮铸等[16]研究发现，山羊MyoG基因内含子Ⅱ存在1个SNP位点C1823T，该位点有3种基因型：AA、AB和BB。储明星等[31]研究发现，绵羊MyoG基因上有1处C183T突变，导致丙氨酸（GCC）错义突变为缬氨酸（GTC）。

本试验对大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊和杜泊羊的MyoG基因内含子Ⅱ遗传分析得到AA、AB和BB 3种基因型，这与刘铮铸等[29]在波尔山羊和王琼等[12]在鸡MyoG基因内含子上分型结果一致，其中MyoG基因内含子Ⅱ在大尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊上的优势基因为B，这与刘铮铸等[29]在山羊上的试验结果相同；而在大尾寒羊和豫西脂尾羊上未检测到AA基因型，可能与试验数据较少有关。 在5个绵羊群体中，只有湖羊MyoG基因内含子Ⅱ符合哈代-温伯格平衡状态，说明该群体遗传受到了较少的人为和定向选择。5个群体的多态信息含量均为中度多态，说明变异程度较高，选择潜力相对较大。

3.2 MyoG基因与绵羊生产性状的关联分析

MyoG基因是影响动物产肉能力的主效基因[32]，在猪、牛、羊等上研究较多[33-35]，在禽类上多见于对肉品质的影响[36]。李云霞等[37]研究发现，在伊犁马MyoG基因外显子1中检测出5个SNPs位点，其中SNP1（g.31187343 A>C）、SNP3（g.31187132 C>T）和SNP4（g.31197105 C>G）位点不同基因型对肉品质及肌纤维性状有显著影响。韦宏伟[38]在天府肉羊和成都麻羊MyoG基因内含子1上发现C/T突变，PCR-SSCP分型得到3种基因型：EE、EF、FF，不同基因型与体重显著关联。Bai等[39]研究表明，在肉用鹌鹑MyoG基因5′-UTR A、B位点发现AA、AB、BB 3种基因型，其中A位点与肉用鹌鹑肝脏重均呈显著相关，B位点与体重、胴体重、胴体净重、肝脏重量、胸肌重量和腿肌重量均呈显著相关。孙伟等[40]研究发现，MyoG基因表达量随湖羊日龄延长而增长，其基因表达水平与宰前活重、胴体重和净肉重成正比。白俊艳等[27，41]研究发现，绵羊MyoG基因外显子Ⅰ上存在AA、AB、BB 3种基因型，不同基因型与水分和色泽等肉质性状显著相关；在3个鹌鹑群体MyoG基因5′-UTR A位点发现AA、BB、AB、CC、AC、BC 6种基因型，且不同基因型与其体重、胫长、胸宽、胸深、胸骨长及体长等均呈显著相关，在B位点检测出AA、BB、CC、DD、EE、AB、AC、AD、AE 9种基因型，且不同基因型与其体重和胫长等生长性状均呈显著相关。本试验结果表明，MyoG基因内含子Ⅱ的AA、AB基因型个体胸围、胸宽、头长、颈长均显著高于BB基因型，与姚毅等[28]、柴志欣等[13]、白俊艳等[41]研究结果相似。MyoG基因在不同物种间具有不同的多态性，含有丰富的遗传信息，不同的基因型影响不同的生长性状，可能是因为碱基突变改变了氨基酸结构功能或改变基因的转录效率[42]。

4 结 论

5个绵羊群体MyoG基因内含子Ⅱ中存在3种基因型：AA（368/540 bp）、AB（908/368/540 bp）、BB（908 bp），优势基因型均为AB基因型。关联分析表明，该酶切位点与胸围、胸宽、头长、颈长等生长性状均呈显著相关。MyoG基因内含子Ⅱ的Eco72 Ⅰ位点可以作为影响绵羊生长性状的分子标记。本研究结果可为今后绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供参考价值。